专利名称：鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法
技术领域：
本发明涉及一种脉冲场凝胶电泳分型方法，尤其是一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法。
背景技术：
链球菌是在自然界中广泛存在的一种条件致病菌，2009年以来，由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus inia)引起的链球菌病严重制约了我国罗非鱼产业的发展，并呈现发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年升高，易感罗非鱼规格范围逐年扩大等新趋势。传染性疾病的爆发，需要对致病微生物进行分型，分型方法包括基于表型特征分析的表型方法和基于基因型特征的基因型方法。目前流行的基因型分型方法包括质粒分型、限制性内切酶分析(REA)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型和基于PCR(聚合酶链反应,polymerase chain react ion )技术的随机扩增多态性DNA标记(RAPD )、扩增片段长度多态性(AFLP)、细菌基因组重复序列PCR技术(I^p PCR)和多位点序列分型(MLST)等。质粒分型的缺点是检测对象是质粒，而不是遗传稳定性更高的染色体；REA技术的缺点是大量小片段DNA用传统琼脂糖电泳难以区分和比较；PCR技术的优点是快速便捷，缺点是检测的都只是染色体的部分片段；而脉冲场凝胶电泳分型方法应用广泛，重复性和稳定性高，检测的是整个染色体DNA，不受表型性状易变的影响，被认为是微生物分子分型的金标准。但目前国 际上的链球菌脉冲场凝胶电泳的实验流程一般需要6 8天，耗时较长。脉冲场凝胶电泳的结果取决于DNA分离应用的实验条件以及所研究的微生物的属和种。胶块的制备、细胞的裂解、胶块的水洗温度和时间限制性内切酶选择，电泳参数等许多因素都能影响脉冲场凝胶电泳的结果。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，其对链球菌具有更强、更快的分型区分能力。按照本发明提供的技术方案，一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，采用从鱼源上分离并培养得到的链球菌作为分析样品，特征是，包括以下工艺步骤:(I)胶块制备:(1-1)、将链球菌样品在血平板培养基上培养18 24小时后,用无菌接种环刮取单菌落重悬于2ml的TE缓冲液中，得到细菌悬浊液，调整细菌悬浊液的OD值为3.6 4.5 ;(1-2)、取160 185 μ L细菌悬浊液于1.5ml离心管中，加入5 10 μ L浓度为10mg/ml的溶菌酶，混合均匀；将细菌悬浊液与溶菌酶的混合溶液置于37°C水浴中孵育15 30分钟；从水浴中取出离心管,加入5 10μ L浓度为20mg/ml的蛋白酶K和5 20 μ L浓度为lmg/ml的变溶菌素；(1-3)、将TBE缓冲液和低熔点琼脂糖混合，每100ml TBE缓冲液中加入I 1.5g低熔点琼脂糖，得到凝胶溶液；将凝胶溶液放置在42 45°C的水浴中平衡，备用；
(1-4)、将200 μ L凝胶溶液加入步骤(1_2)得到的细菌悬浊液中，混合均匀；(1-5)、将步骤(1-4)得到的混合物加入成胶模具进行凝固，避免气泡产生，在室温下凝固15分钟，得到胶块；(2)细胞裂解:(2-1)、配制细胞裂解液:将1.5ml的ES缓冲液加入到50 75 μ L浓度为20mg/ml的蛋白酶K中，混合均匀，得到细胞裂解液；将细胞裂解液置于冰上，备用；(2-2)、将1.5ml细胞裂解液加入到2ml的螺旋盖离心管中；(2-3)、将步骤(1-5)得到的胶块放入步骤(2-2)的螺旋盖离心管中，用刀片削去成胶模具表面多余的胶块，并保证胶块在液面以下，不与离心管的管壁接触；(2-4)、将步骤(2-3)的螺刻盖离心管放置在54 56°C水浴摇床中孵育90 120min，摇床转速为120 170转/分钟；(3)洗胶块:(3-1)、将TE缓冲液和纯水放置在50°C的水浴摇床中预热，备用；(3-2)、将步骤(2-4)处理后的螺旋盖离心管从水浴摇床中拿出，盖上滤筛盖，倒掉螺旋盖离心管中的细胞裂解液；将胶块转移至5ml的螺旋盖离心管中，向该5ml的螺旋盖离心管中加入4ml经步骤(3-1)预热后的纯水，确保胶块位于液面以下，将螺旋盖离心管放回50°C水浴摇床中摇10 15分钟，水浴处理结束将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；再次向螺刻盖离心管中加入4ml步骤(3-1)预热后的纯水，50°C水浴摇床中摇10 15分钟，水浴处理后将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；(3-3)、向步骤(3-2)处理后的胶块中加入4ml经步骤(3_1)预热后的TE缓冲液，再在50°C的水浴摇床中摇10 15分钟，倒掉TE缓冲液；(3-4)、重复步骤(3-3)2 3次后，向胶块中加入4ml的TE缓冲液，放置在4°C的冰箱中保存备用；(4)胶块内DNA的酶切:(4-1)、配制酶缓冲稀释液:将180 μ L纯水与20 μ L的Sma I限制性内切酶IOX缓冲液混合，得到200 μ L酶缓冲稀释液；(4-2)、在1.5ml离心管中加入200 μ L酶缓冲稀释液；(4-3)、将步骤(3-4)得到的胶块放在培养皿上，切成2mm宽的小胶块，将小胶块放入步骤(4-2)的离心管中，确保小胶块处在液面以下，并将离心管放在冰上孵育10 15分钟；(4-4)、配制Sma I限制性内切酶的缓冲液:将174 μ L纯水、2 μ L浓度为lmg/ml的牛血清蛋白、20 μ L的Sma I限制性内切酶IOX缓冲液和40U的Sma I限制性内切酶混合，得到200 μ L的Sma I限制性内切酶的缓冲液；(4-5)、向经步骤(4-3)孵育后的离心管中加入200 μ L的Sma I限制性内切酶的缓冲液，保证小胶块位于液面以下，常温孵育3 5小时；(5)加样:(5-1)、使电泳梳子齿与胶槽的底面距离为I 2mm,调整胶槽至水平位置；(5-2)、倒掉步骤(4-5)所述离心管中的Sma I限制性内切酶缓冲液，并向离心管中加入200 μ L的TBE缓冲液，备用；
(5-3)、将电泳梳子平放在胶槽上，把步骤(5-2)所述离心管中的小胶块取出加在电泳梳子齿上，用吸水纸边缘吸去小胶块周围的液体，在室温下风干3 5分钟；(5-4)、将步骤(5-3)加过样的电泳梳子放入胶槽，确保电泳梳子齿上所有的胶块在一条直线上，并且胶块与胶槽的底面距离为I 2mm ;从胶槽的下部中央缓慢倒入IOOml温度为50 60°C的脉冲场琼脂糖溶液，避免气泡的生成，再在室温下凝固20 30分钟；所述脉冲场琼脂糖溶液由Ig脉冲场琼脂糖加入IOOml的TBE溶液中得到；(6)电泳:(6-1)、在电泳槽中加入2.2L的TBE缓冲液，关上盖子，保持电泳槽中的温度为14。。；(6-2)、将经步骤(5-4)凝固好的胶块放入经步骤(6_1)处理后的电泳槽中，进行电泳；所述电泳时的电压为6V/cm,脉冲时间为10 45秒，电场夹角为120° ,电泳时间为22小时；(7)图像获取:(7-1)、取出经步骤(6-2)电泳处理的胶块，放在盛放有400ml浓度为0.5 μ g/ml的EB溶液的托盘内，将托盘放置在摇床上摇20 30分钟；再在托盘中的EB溶液换成400ml纯水，于摇床上脱色30 60分钟；(7-2)、从托盘中取出胶块，吸除胶块上多余的水份，在凝胶成像系统下拍摄图像。步骤(1-1)所述TE 缓冲液的组份为:IOOmM TrisUOOmM EDTA, pH 为 7.6。步骤(3-1)所述TE缓冲液的组份为:10mM TrisUmM EDTA, pH为 .6。步骤(1-3)、步骤(5-2)、步骤(5-4)、步骤(6-1)所述的TBE缓冲液为0.5ΧΤΒΕ缓冲液。步骤(2-1)所述的ES缓冲液的组份为:0.5M EDTA、lg/100ml十二烷基肌氨酸，pH为 9.0。本发明与已有技术相比具有以下优点:本发明从溶菌酶、蛋白酶K和变溶菌素的用量、洗胶块的水浴温度和电泳参数三方面优化了现有技术中的链球菌PFGE方案，使其成为一种适用于鱼源链球菌的PFGE的最佳方案。与现有技术中的链球菌PFGE方案相比，本发明方法对鱼源链球菌的区分能力更强，整个实验流程耗时缩短了 3 4天，这对于鱼源链球菌病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等具有非常重要的意义。
图1为采用实施例1的方法对2009 2011年我国罗非鱼主产区收集的无乳链球菌(菌株信息见表I中标号I 14)进行脉冲场凝胶电泳分型后的电泳结果；1 14泳道，显示无乳链球菌有4种不同的带型，表明有4种不同基因型。图2为采用实施例2的方法对2009 2011年我国罗非鱼主产区收集及广西水产研究所赠送的链球菌(菌 株信息见表I中标号15 21)进行脉冲场凝胶电泳分型后的电泳结果；15 18泳道为无乳链球菌，显示有2种不同的带型，表明有2种不同基因型；19 21泳道为海豚链球菌，显示有3种不同的带型，表明有3种不同基因型。
具体实施例方式下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明中所使用的Sma I限制性内切酶为市售产品，其中Sma I限制性内切酶IOX缓冲液是购买Sma I限制性内切酶时提供的和Sma I限制性内切酶配套使用的IOX缓冲液。本发明实施例1、实施例2所采用的链球菌样品是从海南、广西等罗非鱼养殖场分离获得的19株菌株，以及由广西水产研究所赠送的2株链球菌菌株，具体如表I所示。表1 2009 2011年我国罗非鱼主产区收集的链球菌
权利要求
1.一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，采用从鱼源上分离并培养得到的链球菌作为分析样品，其特征是，包括以下工艺步骤: (1)I父块制备: (1-1)、将链球菌样品在血平板培养基上培养18 24小时后，用无菌接种环刮取单菌落重悬于2ml的TE缓冲液中，得到细菌悬浊液，调整细菌悬浊液的OD值为3.6 4.5 ; (1-2)、取160 185 μ L细菌悬浊液于1.5ml离心管中，加入5 10 μ L浓度为IOmg/ml的溶菌酶，混合均匀；将细菌悬浊液与溶菌酶的混合溶液置于37°C水浴中孵育15 30分钟；从水浴中取出离心管，加入5 10^浓度为2011^/1111的蛋白酶K和5 20 μ L浓度为lmg/ml的变溶菌素； (1-3)、将TBE缓冲液和低熔点琼脂糖混合，每100ml TBE缓冲液中加入I 1.5g低熔点琼脂糖，得到凝胶溶液；将凝胶溶液放置在42 45°C的水浴中平衡，备用； (1-4)、将200 μ L凝胶溶液加入步骤(1-2)得到的细菌悬浊液中，混合均匀； (1-5)、将步骤(1-4)得到的混合物加入成胶模具进行凝固，避免气泡产生，在室温下凝固15分钟，得到胶块； (2)细胞裂解: (2-1)、配制细胞裂解液:将1.5ml的ES缓冲液加入到50 75 μ L浓度为20mg/ml的蛋白酶K中，混合均匀，得到细胞裂解液；将细胞裂解液置于冰上，备用； (2-2)、将1.5ml细胞裂解液加入到2ml的螺旋盖离心管中； (2-3)、将步骤(1-5)得到的胶块放入步骤(2-2)的螺旋盖离心管中，用刀片削去成胶模具表面多余的胶块，并保证胶块在液面以下，不与离心管的管壁接触； (2-4)、将步骤(2-3)的螺刻盖离心管放置在54 56°C水浴摇床中孵育90 120min，摇床转速为120 170转/分钟； (3)洗胶块: (3-1)、将TE缓冲液和纯水放置在50°C的水浴摇床中预热，备用； (3-2)、将步骤(2-4)处理后的螺旋盖离心管从水浴摇床中拿出，盖上滤筛盖，倒掉螺旋盖离心管中的细胞裂解液；将胶块转移至5ml的螺旋盖离心管中，向该5ml的螺旋盖离心管中加入4ml经步骤(3-1)预热后的纯水，确保胶块位于液面以下，将螺旋盖离心管放回50°C水浴摇床中摇10 15分钟，水浴处理结束将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；再次向螺刻盖离心管中加入4ml步骤(3-1)预热后的纯水，50°C水浴摇床中摇10 15分钟，水浴处理后将螺旋盖离心管中的纯水倒掉； (3-3)、向步骤(3-2)处理后的胶块中加入4ml经步骤(3_1)预热后的TE缓冲液，再在50°C的水浴摇床中摇10 15分钟，倒掉TE缓冲液； (3-4)、重复步骤(3-3)2 3次后，向胶块中加入4ml的TE缓冲液，放置在4°C的冰箱中保存备用； (4)胶块内DNA的酶切: (4-1)、配制酶缓冲稀释液:将180 μ L纯水与20 μ L的Sma I限制性内切酶IOX缓冲液混合，得到200 μ L酶缓冲稀释液； (4-2)、在1.5ml 离心管中加入200 μ L酶缓冲稀释液； (4-3),将步骤(3-4)得到的胶块放在培养皿上，切成2mm宽的小胶块，将小胶块放入步骤(4-2)的离心管中，确保小胶块处在液面以下，并将离心管放在冰上孵育10 15分钟；(4-4)、配制Sma I限制性内切酶的缓冲液:将174 μ L纯水、2 μ L浓度为lmg/ml的牛血清蛋白、20 μ L的Sma I限制性内切酶10 X缓冲液和40U的Sma I限制性内切酶混合，得到200 μ L的Sma I限制性内切酶的缓冲液； (4-5)、向经步骤(4-3)孵育后的离心管中加入200 μ L的Sma I限制性内切酶的缓冲液，保证小胶块位于液面以下，常温孵育3 5小时； (5)加样: (5-1)、使电泳梳子齿与胶槽的底面距离为I 2_，调整胶槽至水平位置； (5-2)、倒掉步骤(4-5)所述离心管中的Sma I限制性内切酶缓冲液，并向离心管中加入200yL的TBE缓冲液，备用； (5-3)、将电泳梳子平放在胶槽上，把步骤(5-2)所述离心管中的小胶块取出加在电泳梳子齿上，用吸水纸边缘吸去小胶块周围的液体，在室温下风干3 5分钟； (5-4)、将步骤(5-3)加过样的电泳梳子放入胶槽，确保电泳梳子齿上所有的胶块在一条直线上，并且胶块与胶槽的底面距离为I 2mm ;从胶槽的下部中央缓慢倒入IOOml温度为50 60°C的脉冲场琼脂糖溶液，避免气泡的生成，再在室温下凝固20 30分钟；所述脉冲场琼脂糖溶液由Ig脉冲场琼脂糖加入IOOml的TBE溶液中得到； (6)电泳: (6-1)、在电泳槽中加入2.2L的TBE缓冲液，关上盖子，保持电泳槽中的温度为14°C ；(6-2)、将经步骤(5-4)凝固好的胶块放入经步骤(6-1)处理后的电泳槽中，进行电泳；所述电泳时的电压为6V/cm,脉冲时间为10 45秒，电场夹角为120° ,电泳时间为22小时； (7)图像获取: (7-1)、取出经步骤(6-2)电泳处理的胶块，放在盛放有400ml浓度为0.5 μ g/ml的EB溶液的托盘内，将托盘放置在摇床上摇20 30分钟；再在托盘中的EB溶液换成400ml纯水，于摇床上脱色30 60分钟； (7-2)、从托盘中取出胶块，吸除胶块上多余的水份，在凝胶成像系统下拍摄图像。
2.如权利要求1所述的鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，其特征是:步骤(1-1)所述 TE 缓冲液的组份为:100mM TrisUOOmM EDTA，pHS7.6。
3.如权利要求1所述的鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，其特征是:步骤(3-1)所述TE缓冲液的组份为:10mM TrisUmM EDTA, pH为7.6。
4.如权利要求1所述的鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，其特征是:步骤(1-3)、步骤(5-2)、步骤(5-4)、步骤(6-1)所述的TBE缓冲液为0.5 X TBE缓冲液。
5.如权利要求1所述的鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，其特征是:步骤(2-1)所述的ES缓冲液的组份为:0.5M EDTAUg/lOOml十二烷基肌氨酸，pH为9.0。
全文摘要
本发明涉及一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，以经分离并培养得到的链球菌为分析样品，依次进行以下各步骤胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样、电泳、图像获取；所述的胶块制备、细胞裂解、洗胶块、加样和图像获取步骤都按照常规脉冲场凝胶电泳方法进行，并对各参数进行优化；所述的洗胶块的水浴温度为50℃；所述的胶块内DNA的酶切酶为SmaI酶；所述的电泳参数中，电压为6V/cm，对应的脉冲时间为10~45秒，电场夹角为120°，电泳温度为14℃，总电泳时间为22小时。本发明对鱼源链球菌区分能力更强，整个实验流程耗时缩短了3~4天，这对于鱼源链球菌病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等具有重要意义。
文档编号G01N27/447GK103196980SQ20131010345
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月27日 优先权日2013年3月27日
发明者杨弘, 祝璟琳, 邹芝英, 单航宇, 韩珏 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心