一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒。所述试剂盒包括用活性氨基团包被的标准组织玻片作为表面载体，将多种抗原特异性抗体通过非接触性点样仪点微阵列在玻片表面；用可拆装的2×8孔塑料框架把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列。每个捕获抗体在每个抗体微阵列中有四次的重复。玻片和框架之间通过两侧的塑料夹板紧扣形成抗体芯片；在玻片表面完成多重夹心ELISA反应的实验试剂。本发明的抗体芯片试剂盒能够同时定量检测多项细胞因子，其灵敏度与单项ELISA类似，但细胞因子的动态检测范围更广，从单一样品实验中可得到四倍于ELISA的重复数据，具有高灵敏度、高通量、样品用量少、廉价、易推广等优点。
【专利说明】-种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学【技术领域】，涉及一种同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片 试剂盒。 技术背景
[0002] 细胞因子（cytokines)是机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的具有调节多 种细胞生理功能的小分子的多肽（低分子蛋白质）。
[0003] 细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感 染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响 细胞代谢等。与免疫有关的细胞因子主要包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核巨噬细胞产 生的单核因子、白细胞介素（interleukin, IL)、干扰素（interferon, IFN)、集落刺激因子 (colony stimulating factor，CSF)、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF)、趋化 因子（chemokine)、转化生长因子 β (transforming growth factori3，TGFi3)等，它们在 免疫系统中起着非常重要的调控作用，在异常情况下也会导致免疫病理反应。
[0004] 细胞因子都是通过与靶细胞表面的细胞因子受体特异结合后才能发挥其生物学 效应，这些效应包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和杀肿瘤细胞效应，促进或抑制 其他细胞因子的合成，促进炎症过程，影响细胞代谢等。细胞因子的这些作用具有网络性的 特点，即每种细胞因子可作用于多种细胞；每种细胞可受多种细胞因子的调节；不同细胞 因子之间具有相互协同或相互制约的作用，由此构成了复杂的细胞因子免疫调节网络。
[0005] 细胞因子研究具有非常重要的理论和实用意义，它有助于阐明分子水平的免疫调 节机理，有助于疾病的预防、诊断和治疗。
[0006] 目前常用的细胞因子的检测方法主要包括：酶联免疫吸附法（ELISA)，放 射免疫分析（radio immunoassay, RIA)，免疫印迹法(western blot),流式细胞仪 (Flow-Cytometry)等。其中，酶联免疫吸附法是最普遍的方法，具灵敏度高、特异性较好、操 作简便等优点。但一次试验只能检测单一指标，通量低、成本高，在具有多指标特性的细胞 因子检测中，该方法存在明显的不足；放射免疫分析（RIA)虽然灵敏度高，是由于具有放射 性污染，现在已很少采用；免疫印迹法能测定分子的大小，且无非特异的反应，但操作繁琐， 灵敏度低，且只能检测单一指标，不适合运用于细胞因子的检测；流式细胞仪能在细胞水平 上检测细胞因子的水平，但却存在低灵敏、低通量、高成本等缺点。
[0007] 在细胞因子的多重ELISA检测上，常用的方法包括液相磁珠法（LUMINEX)和 96-孔ELISA板法。液相磁珠法（LUMINEX)是把不同的捕获抗体固定在有不同荧光波长的 磁珠上，不同的磁珠在同一液相完成反应后流经一检测小管并由两个不同的荧光检测仪来 读数。其中的一个读不同的磁珠信号用以代表不同的检测因子，另一个则读该磁珠上的检 测信号用以代表该因子的浓度。因为固定有不同捕获抗体的磁珠在同一反应体系中进行， 捕获抗体彼此之间就有交叉干扰，以至于同时检测因子的数目有限。另外一个常用的方法 是把不同的捕获抗体以微阵列的方式固定在96-孔酶标板底，然后通过类似ELISA的操作 来达到多因子的联合检测。但由于96孔酶标板受孔径大小限制，在一个孔内点的数目有 限。另外由于96孔酶标板有很强的自身荧光，所以检测通常只能用化学发光法。由于化学 发光法信号的弥散特性以至于检测的数目受到进一步的限制。用以上两类多因子联合检测 的方法一次最多只能检测几个因子，并且检测结果的重复性也差。
[0008] 有鉴于此，有必要开发一种新型的多细胞因子定量检测试剂盒，以克服现有技术 中亟待解决的问题，实现多细胞因子的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本检测。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改良的同时定量检测多个细胞 因子的体芯片试剂盒，该试剂盒采用荧光检测信号，能够同时定量检测几十项细胞因子，克 服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有低成本、便利、高通量、高灵 敏度、高特异性、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。
[0010] 本发明所述的改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒，反应装置包 括固相载体，为用活性氨基包被的标准组织玻片；在一张玻片表面用非接触性点样仪将多 种抗原特异性抗体通过微阵列的方式点有2X8个相同的抗体微阵列，将点有2X8个抗体 微阵列的标准组织玻片用可拆装的2X8孔框架结构把玻片分割成16个互不干扰的小区， 每个小区含有一个抗体微阵列；反应剂包括：抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种 特异性抗体的混合溶液，抗体混合液中的特异性抗体上标记有生物素；识别生物素标记的 链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有荧光染料，所述荧光染料为Cy3或具有类似吸收波长 的荧光染料；细胞因子标准品，包含若干种所述的细胞因子的具有梯级浓度的混合物。 [0011] 根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述的框架结构由三部分组成：上层塑 料硬框，下层软乳胶片，和两侧的塑料夹板；通过两侧的塑料夹板将上层塑料硬框与下层软 乳胶片紧扣在玻片上，形成矩阵为2 X 8的16孔抗体芯片；框架的每个孔的尺寸大小与常规 ELISA的96孔板的孔间距相符，以致适用于标准ELISA系统的自动化操作。
[0012] 根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述的多种抗原特异性抗体是细胞-巨 噬细胞集落刺激因子、干扰素 Y、白介素-2、白介素4、白介素5、白介素6、白介素8、白介素 10、白介素13、和肿瘤坏死因子α这10种T细胞分泌因子的特异性抗体。
[0013] 根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，每种特异性抗体的点制浓度分别为 200ug/ml ;每个捕获抗体在每个抗体微阵列中有四次的重复。
[0014] 根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，芯片处理完成后，拆除可拆装的框架，玻 片由含Cy3通道的激光扫描仪扫描成像，所成的像用芯片读数软件将每个点的荧光信号转 化为数码信号，再通过与细胞因子标准曲线的对应关系，定量测出样品中细胞因子的浓度。
[0015] 与现有技术相比，本发明所述的改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试 剂盒具有以下优点和特点：
[0016] (1)选用没有空间限制的标准组织玻片作为载体，这样点在同一微阵列上检测因 子的数目就可以不受空间的限制。
[0017] (2)本发明采用活性氨基包被的玻片，不仅可增加在玻片上捕获抗体的稳定性，同 时也可以减少背景干扰，增加检测灵敏度。活性氨基包被的玻片多用来作为DNA芯片的载 体，在蛋白芯片的载体选择上还不曾有类似的报导。
[0018] (3)由于不同捕获抗体是分开固定在玻片的表面，所以可以减少捕获抗体彼此干 扰的因素，使得细胞因子高通量检测成为可能。由于玻片具有非常低的自身荧光，而且荧光 信号不具扩散性，不同点间的荧光信号不会彼此干扰，所以一次可以同时检测成上百个细 胞因子。所开发出的这套在玻片表面进行多重ELISA反应的荧光检测的系统不仅一次可以 检测多达几十个细胞因子，并且该系统所检测的细胞因子灵敏度可达到单因子的ELISA检 测灵敏度。
[0019] (4)本发明将点有2X8个抗体微阵列的标准组织玻片用可拆装的2X8孔框架结 构把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列。这样，在同一张玻 片上可同时检测16个不同的样品。该16孔可拆装的框架的尺寸大小与常规96孔板的孔 间距相符，可以适用于标准ELISA系统的自动化操作。与常规ELISA相符，该反应体系为在 玻片表面上进行的多个样品的多重ELISA检测。
[0020] (5)每个捕获抗体在每个抗体微阵列中有四次的重复，因而可以从单一样本中得 到该细胞因子四倍于ELISA的实验结果。
[0021] (6)本发明设计了独特的框架结构，它由三部分组成：上层塑料硬框，下层软乳胶 片，和两侧的塑料夹板。玻片和框架之间通过两侧的塑料夹板紧扣形成抗体芯片，每个孔框 架的尺寸大小与常规96孔板的孔间距相符，因而可适用于标准ELISA系统的自动化操作。 自动化操作系统在标准组织芯片上的应用使得高通量样品的标准化处理成为可能，为芯片 的临床应用铺平道路。
[0022] (7)现有的蛋白检测系统多采用化学发光法。由于化学发光信号的弥散使得能同 时在一个芯片上检测的细胞因子数目受到限制，本发明采用荧光信号不存在信号扩散的问 题，这使得高密度蛋白芯片的开发成为可能。
[0023] (8)本发明实现了对样品中细胞因子的浓度的定量检测。这是因为本发明采用荧 光检测，它具有与化学发光法类似的检测灵敏度，但又具有以下独特的优越性：首先，由于 荧光信号的非扩散性，相同面积芯片上可以同时检测的细胞因子数目可比化学发光法高几 十倍到上百倍。其次，所成的像可根据信号的强弱调节以达到最佳检测效果。再次，荧光成 像的玻片可永久保存。与传统ELISA检测方法不同，芯片处理完成后，拆除可拆装的框架之 后，用含Cy3通道的激光扫描仪对反应结束的玻片进行扫描成像，并存储为.tiff文件。所 成的像用芯片读数软件将每个点的信号转化为数码信号。通过与细胞因子标准曲线的对应 关系，定量测出样品中细胞因子的浓度。
[0024] (9)本发明所述的试剂盒可以同时从单一的样品中定量检测出十个由T辅助细胞 所分泌的细胞因子，其中包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素 Y、白介素-2、白介 素4、白介素5、白介素6、白介素8、白介素10、白介素13和肿瘤坏死因子α等。它可以用 来判断机体所介导的免疫反应是Thl型细胞介导的免疫反应（干扰素 Υ、白介素-2,肿瘤 坏死因子α等）或Th2型体液介导的免疫反应（白介素4、白介素6、白介素10等）以达 到辅助临床疾病诊断的效果。
[0025] (10)可制备成混合溶液进行点样。现有的检测芯片，点样后处理通常包括水合、紫 外交联、洗脱、封闭等步骤。由于本发明所采用的点样液的优良特性，使得将特异性抗体固 定于玻片的步骤等到了极大的简化，无须现有技术中普遍采用的点样后封闭玻片上的有效 成分的操作步骤。
[0026] 为确保样品间不容易发生相互作用以致影响检测结果，以便发展成高通量方法， 在本发明的一个实施例中，采用美国伯乐（Bio-Rad)公司或钼金艾尔默（Perkin Elmer)公 司生产的全自动点样仪器。各特异性抗体蛋白质芯片点阵排布于玻片，而在具体的操作过 程中，各特异性抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体蛋白芯片排 布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为本发明蛋白质芯片试剂盒工作原理图。
[0028] 图2本发明细胞因子检测蛋白质芯片试剂盒的蛋白质芯片的点样示意图。
[0029] 图3配制系列标准品浓度的示意图。
【具体实施方式】
[0030] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0031] 实施例1 :最佳抗体芯片载体的筛选。
[0032] 常规的抗体芯片多以硝酸纤维素膜为载体，由于硝酸纤维素膜是多层结构，芯片 的洗涤难度大，以致芯片的结果波动大。同时由于硝酸纤维素膜芯片不易于大规模的操作， 用于大规模临床样本的使用还不普遍。不同的厂家用不同的方法把硝酸纤维素膜固定在玻 片的表面，其中有Whatman的SS玻片，它在一张玻片上固定了 16个含硝酸纤维素膜的小 区，另外Gentel用加工过的硝酸纤维素材料包被在玻片表面而生产了 PATH玻片。除此以 夕卜，为了使抗体包被在玻片表面，我们筛选了不同方法活化的载体。用全自动点样仪把Cy3 和Cy5标记的链霉亲和素点在在玻片的表面，然后用激光扫描仪来读数。实验结果如下表 所示。硝酸纤维素膜芯片在Cy3通道有强的信号，但它们的背景也高。用活性氨基包被的 玻片在Cy3通道时有最高的信号背景比。
[0033]
【权利要求】
1. 一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒，其特征在于： 反应装置包括固相载体，为用活性氨基包被的标准组织玻片；在一张玻片表面用非接 触性点样仪将多种抗原特异性抗体通过微阵列的方式点有2X8个相同的抗体微阵列，将 点有2X8个抗体微阵列的标准组织玻片用可拆装的2X8孔框架结构把玻片分割成16个 互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列； 反应剂包括：抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶液，抗体 混合液中的特异性抗体上标记有生物素；识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素 标记有荧光染料，所述荧光染料为Cy3或具有类似吸收波长的荧光染料；细胞因子标准品， 包含若干种所述的细胞因子的具有梯级浓度的混合物。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的框架结构由三部分组成：上层塑 料硬框，下层软乳胶片，和两侧的塑料夹板；通过两侧的塑料夹板将上层塑料硬框与下层软 乳胶片紧扣在玻片上，形成矩阵为2 X 8的16孔抗体芯片；框架的每个孔的尺寸大小与常规 ELISA的96孔板的孔间距相符，以致适用于标准ELISA系统的自动化操作。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的多种抗原特异性抗体是细 胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素 Y、白介素-2、白介素4、白介素5、白介素6、白介素8、 白介素10、白介素13和肿瘤坏死因子α这10种T细胞分泌因子的特异性抗体。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：每种特异性抗体的点样浓度分别为 200ug/ml ;每个捕获抗体在每个抗体微阵列中有四次的重复。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：每种特异性抗体的点样液为含有 0. 01-10g/100ml牛白蛋白的PBS缓冲液。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：芯片处理完成后，拆除可拆装的框架， 玻片由含Cy3通道的激光扫描仪扫描成像，所成的像用芯片读数软件将每个点的荧光信号 转化为数码信号，再通过与细胞因子标准曲线的对应关系，定量测出样品中细胞因子的浓 度。
【文档编号】G01N21/64GK104111329SQ201310135080
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月17日 优先权日:2013年4月17日
【发明者】黄若磐, 毛应清 申请人:广州瑞博奥生物科技有限公司, 广州华南生物芯片研究中心