超敏c反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】一种超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法，包括HS-CRP反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP?ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG；所述的HS-CRP反应板包括吸水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG。其目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法。
【专利说明】超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是超敏C反应蛋白 (HS-CRP)荧光免疫层析法定量测定试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] C反应蛋白（C-reactive protein, CRP)因其能和肺炎双球菌的细胞壁的C多糖起 沉淀反应而得名，是相对分子质量为115-140KD的血清β球蛋白。CRP持续增高提示机体 存在慢性炎症或自身免疫疾病，CRP在病毒感染时不会升高，其变化不受患者的个体差异、 机体状态和治疗药物的影响。近年来，随着检测技术的进步，采用超敏感方法检测到的CRP 被称为超敏CRP。大量的文章研究显示，它在冠心病、中风、周围血管栓塞等疾病诊断和预测 中发挥越来越重要的作用，甚至被认为是心血管病危险评估的"金标准"。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式 简便，检测结果准确可靠的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法。
[0004] 本发明的超敏C反应蛋白（HS-CRP)荧光免疫层析法检测试剂盒，包括HS-CRP反 应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的 小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG ;所述的HS-CRP反应板包括吸 水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG ;
[0005] 所述HS-CRP反应板采用如下步骤制成：
[0006] (1)、取 3. 44gNa2HP04H20,100g 蔗糖，2. lg 吐温 20 (TWEEN-20)，10gPVPK-30,全部加 入1L烧瓶中，再向加入1L烧瓶中800ml纯化水，充分搅拌混匀；
[0007] (2)、向加入1L烧瓶中加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7. 40-7. 45范围 内，定容至l〇〇〇ml ;
[0008] (3)、取20ml步骤⑵得到的液体，加入到50ml烧杯中，再向50ml烧杯中加入4mg 小鼠抗人CRP抗体，编号AB2,使抗体的终浓度为0. 2mg/ml ;
[0009] (4)、取20ml步骤（2)得到的液体，加入到另一个50ml烧杯中，加入6mg兔IgG,使 兔IgG终浓度为0· 3mg/ml ;
[0010] (5)、取硝酸纤维素膜（NC膜），将其裁剪为宽为2. 5cm的长条，长条的一端设定为 A端，另一端设定为B端，将步骤（3)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1 μ 1/cm，在距 A端1. 4cm处划线即为检测线；将步骤⑷制得的液体装入划膜机，设定划线量为1 μ 1/cm， 在距A端1. lcm处划线即为质控线；
[0011] (6)、将步骤（5)制备的硝酸纤维素膜（NC膜）在37度下干燥至少2小时，干燥环 境湿度恒定在20%以下；
[0012] (7)、将硝酸纤维素膜（NC膜）的非点样面粘帖在PVC底板上，将样品垫裁剪为2cm 宽的长条，粘帖于B端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜（NC膜）B端2mm，将吸收垫裁剪为 1. 8cm宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜（NC膜）A端约5mm，用滚刷 轻压已粘帖好的检测版；
[0013] (8)、用剪切机从A端到B端裁剪为3mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放 入铝箔袋，抽真空并封口，即得HS-CRP反应板；
[0014] 所述HS-CRP检测缓冲液采用如下步骤制成：
[0015] (1)、准备lmg含突光标记的小鼠抗人CRP的单克隆抗体，编号AB1，使用Sephadex G25层析柱用0. 2M NaHC03 pH9. 0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2. 5ml，将其浓缩为2ml， 终浓度为lmg/ml ;
[0016] (2)、用 0· 2M NaHC03PH9. 0 溶液配置 0· 5mg/ml 的 Alexa Fluor610 溶液，并将其转 移到棕色玻璃瓶中；
[0017] (3)、按照以下公式计算需要加入的0. 5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
[0018] 抗体量（mg) Χ0· 102 (ml/mg) = 0· 5mg/ml Alexa Fluor610 的体积，
[0019] 此处需要加入 0· 102ml Alexa Fluor610
[0020] (4)、在室温下搅拌混匀16小时；
[0021] (5)、使用S印hadex G25层析柱用0· 2M NaHC03pH9. 0溶液对步骤（4)制备的液体 进行脱盐处理，将收集液用〇. 2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2. 5ml，得到1号过滤 液；
[0022] (6)、准备lmg含荧光标记的羊抗兔IgG，编号AB2,使用S印hadex G25层析柱用 0. 2MNaHC03pH9. 0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2. 5ml，将其浓缩为2ml ;终浓度为lmg/ ml ；
[0023] (7)、用 0· 2M NaHC03 ΡΗ9· 0 溶液配置 0· 5mg/ml 的 Alexa Fluor610 溶液，并将其 转移到棕色玻璃瓶中；
[0024] (8)、按照以下公式计算需要加入的0· 5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
[0025] 抗体量（mg) Χ0· 102 (ml/mg) =0· 5mg/ml Alexa Fluor610 的体积，
[0026] 此处需要加入 0· 102ml Alexa Fluor610
[0027] (9)、在室温下搅拌混匀16小时；
[0028] (10)、使用S印hadex G25层析柱用0· 2M NaHC03 ρΗ9· 0溶液对步骤（9)制备的液 体进行脱盐处理，将收集液用〇. 2ΜΜ滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2. 5ml，得到二号 过滤液；
[0029] (11)、配置lOOmlO. 01M的ρΗ7· 2的PBS，然后向PBS中添加 2g的BSA，向PBS中添 加〇. 3g的吐温20 (TWEEN-20)，向PBS中添加0. 04g的casein，得到制备液；
[0030] (12)、将步骤（5)所得的液体按照1份一号过滤液：1500份制备液的比例添加到 步骤（11)制备的液体中，将步骤（10)所得的液体按照1份二号过滤液：500份制备液的比 例添加到步骤（11)制备的液体中，即得HS-CRP检测缓冲液。
[0031] 所述的HS-CRP ID芯片采用以下步骤制成：
[0032] 将HS-CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片， 即得HS-CRP ID芯片。
[0033] 本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其中所述HS-CRP ID芯片 中所存储的标准曲线中各标准点的浓度分别为〇、1. 〇、2. 0、4. 0、8. 0、10. 0μ g/ml。
[0034] 本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其中所述室温的温度为 20°C -24°C。
[0035] 本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的检测方法，包括如下步 骤：
[0036] 1)、将10 μ 1的样本加入500 μ 1的所述检测缓冲液中，充分混匀；
[0037] 2)、取60 μ 1混合液，加入到HS-CRP反应板的测试区，反应3分钟；
[0038] 3)、将HS-CRP反应板放入荧光检测仪中，插入ID卡，仪器自动测量并出结果报告。
[0039] 本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法，包括HS-CRP 反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的 小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG ;所述的HS-CRP反应板包括吸 水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG ;通过上千例的 大量实验表明，本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法，具有 特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果极其准确可靠（实 验中的准确率高达100% )的特点，具有突出的实质性特点和显著的进步。
[0040] 下面对本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法作进 一步详细说明。
【具体实施方式】
[0041] 本发明的超敏C反应蛋白（HS-CRP)荧光免疫层析法检测试剂盒，包括HS-CRP反 应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的 小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG ;所述的HS-CRP反应板包括吸 水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG ;
[0042] 所述HS-CRP反应板采用如下步骤制成：
[0043] (1)、取 3. 44gNa2HP04H20,100g 蔗糖，2. lg 吐温 20 (TWEEN-20)，10gPVPK-30,全部加 入1L烧瓶中，再向加入1L烧瓶中800ml纯化水，充分搅拌混匀；
[0044] (2)、向加入1L烧瓶中加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7. 40-7. 45范围 内，定容至l〇〇〇ml ;
[0045] (3)、取20ml步骤⑵得到的液体，加入到50ml烧杯中，再向50ml烧杯中加入4mg 小鼠抗人CRP抗体，编号AB2,使抗体的终浓度为0. 2mg/ml ;
[0046] (4)、取20ml步骤（2)得到的液体，加入到另一个50ml烧杯中，加入6mg兔IgG,使 兔IgG终浓度为0· 3mg/ml ;
[0047] (5)、取硝酸纤维素膜（NC膜），将其裁剪为宽为2. 5cm的长条，长条的一端设定为 A端，另一端设定为B端，将步骤（3)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1 μ 1/cm，在距 A端1. 4cm处划线即为检测线；将步骤（4)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1 μ 1/cm， 在距A端1. lcm处划线即为质控线；
[0048] (6)、将步骤（5)制备的硝酸纤维素膜（NC膜）在37度下干燥至少2小时，干燥环 境湿度恒定在20%以下；
[0049] (7)、将硝酸纤维素膜（NC膜）的非点样面粘帖在PVC底板上，将样品垫裁剪为2cm 宽的长条，粘帖于B端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜（NC膜）B端2mm，将吸收垫裁剪为 1. 8cm宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜（NC膜）A端约5mm，用滚刷 轻压已粘帖好的检测版；
[0050] (8)、用剪切机从A端到B端裁剪为3mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放 入铝箔袋，抽真空并封口，即得HS-CRP反应板；
[0051] 所述HS-CRP检测缓冲液采用如下步骤制成：
[0052] (1)、准备lmg含突光标记的小鼠抗人CRP的单克隆抗体，编号AB1，使用Sephadex G25层析柱用0. 2M NaHC03pH9. 0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2. 5ml，将其浓缩为2ml，终 浓度为lmg/ml ;
[0053] (2)、用 0· 2M NaHC03PH9. 0 溶液配置 0· 5mg/ml 的 Alexa Fluor610 溶液，并将其转 移到棕色玻璃瓶中；
[0054] (3)、按照以下公式计算需要加入的0. 5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
[0055] 抗体量（mg) Χ0· 102 (ml/mg) = 0· 5mg/ml Alexa Fluor610 的体积，
[0056] 此处需要加入 0· 102ml Alexa Fluor610
[0057] (4)、在室温下搅拌混匀16小时；
[0058] (5)、使用S印hadex G25层析柱用0· 2M NaHC03 ρΗ9· 0溶液对步骤（4)制备的液 体进行脱盐处理，将收集液用〇. 2ΜΜ滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2. 5ml，得到1号过 滤液；
[0059] (6)、准备lmg含突光标记的羊抗兔IgG，编号AB2,使用Sephadex G25层析柱用 0. 2MNaHC03pH9. 0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2. 5ml，将其浓缩为2ml ;终浓度为lmg/ ml ；
[0060] (7)、用 0· 2M NaHC03PH9. 0 溶液配置 0· 5mg/ml 的 Alexa Fluor610 溶液，并将其转 移到棕色玻璃瓶中；
[0061] (8)、按照以下公式计算需要加入的0. 5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
[0062] 抗体量（mg) Χ0· 102 (ml/mg) =0· 5mg/ml Alexa Fluor610 的体积，
[0063] 此处需要加入 0· 102ml Alexa Fluor610
[0064] (9)、在室温下搅拌混匀16小时；
[0065] (10)、使用S印hadex G25层析柱用0· 2M NaHC03 ρΗ9· 0溶液对步骤（9)制备的液 体进行脱盐处理，将收集液用〇. 2ΜΜ滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2. 5ml，得到二号 过滤液；
[0066] (11)、配置lOOmlO. 01M的ρΗ7· 2的PBS，然后向PBS中添加2g的BSA，向PBS中添 加〇. 3g的吐温20 (TWEEN-20)，向PBS中添加0. 04g的casein，得到制备液；
[0067] (12)、将步骤（5)所得的液体按照1份一号过滤液：1500份制备液的比例添加到 步骤（11)制备的液体中，将步骤（10)所得的液体按照1份二号过滤液：500份制备液的比 例添加到步骤（11)制备的液体中，即得HS-CRP检测缓冲液。
[0068] 所述的HS-CRP ID芯片采用以下步骤制成：
[0069] 将HS-CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片， 即得HS-CRP ID芯片。
[0070] 所述HS-CRP ID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度分别为0、1. 0、2. 0、 4· 0、8· 0、10. 0 μ g/ml。
【权利要求】
1.超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：包括HS-CRP反应板， HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗 人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG ;所述的HS-CRP反应板包括吸水纸，硝 酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG ; 所述HS-CRP反应板采用如下步骤制成： (1) 、取 3. 44gNa2HP04H20,100g 蔗糖，2. lg 吐温 20 (TWEEN-20)，10gPVPK-30,全部加入 1L 烧瓶中，再向加入1L烧瓶中800ml纯化水，充分搅拌混匀； (2) 、向加入1L烧瓶中加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7. 40-7. 45范围内，定 容至 1000ml ; (3) 、取20ml步骤⑵得到的液体，加入到50ml烧杯中，再向50ml烧杯中加入4mg小 鼠抗人CRP抗体，编号AB2,使抗体的终浓度为0. 2mg/ml ; (4) 、取20ml步骤⑵得到的液体，加入到另一个50ml烧杯中，加入6mg兔IgG，使兔 IgG终浓度为0· 3mg/ml ; (5) 、取硝酸纤维素膜（NC膜），将其裁剪为宽为2. 5cm的长条，长条的一端设定为A端， 另一端设定为B端，将步骤（3)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1 μ 1/cm，在距A端 1. 4cm处划线即为检测线；将步骤⑷制得的液体装入划膜机，设定划线量为1 μ 1/cm，在距 A端1. lcm处划线即为质控线； (6) 、将步骤（5)制备的硝酸纤维素膜（NC膜）在37度下干燥至少2小时，干燥环境湿 度恒定在20%以下； (7) 、将硝酸纤维素膜（NC膜）的非点样面粘帖在PVC底板上，将样品垫裁剪为2cm宽的 长条，粘帖于B端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜（NC膜）B端2mm，将吸收垫裁剪为1. 8cm 宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜（NC膜）A端约5mm，用滚刷轻压已 粘帖好的检测版； (8) 、用剪切机从A端到B端裁剪为3mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝 箔袋，抽真空并封口，即得HS-CRP反应板； 所述HS-CRP检测缓冲液采用如下步骤制成： (1) 、准备lmg含荧光标记的小鼠抗人CRP的单克隆抗体，编号AB1，使用S印hadex G25 层析柱用〇. 2M NaHC03 pH9. 0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2. 5ml，将其浓缩为2ml，终浓 度为 lmg/ml ; (2) 、用 0. 2M NaHC03 PH9. 0 溶液配置 0. 5mg/ml 的 Alexa Fluor610 溶液，并将其转移 到棕色玻璃瓶中； (3) 、按照以下公式计算需要加入的0. 5mg/ml的Alexa Fluor610的体积 抗体量（mg)XO. 102(ml/mg) = 0· 5mg/ml Alexa Fluor610 的体积， 此处需要加入 〇· 102ml Alexa Fluor610 (4) 、在室温下搅拌混匀16小时； (5) 、使用S印hadex G25层析柱用0. 2M NaHC03pH9. 0溶液对步骤（4)制备的液体进行 脱盐处理，将收集液用0. 2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2. 5ml，得到1号过滤液； (6) 、准备lmg含荧光标记的羊抗兔IgG，编号AB2,使用S印hadex G25层析柱用 0. 2MNaHC03pH9. 0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2. 5ml，将其浓缩为2ml ;终浓度为lmg/ ml ： (7) 、用(λ 2M NaHC03PH9. 0溶液配置(λ 5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到 棕色玻璃瓶中； (8) 、按照以下公式计算需要加入的0. 5mg/ml的Alexa Fluor610的体积 抗体量（mg)XO. 102(ml/mg) = 0· 5mg/ml Alexa Fluor610 的体积， 此处需要加入 〇· 102ml Alexa Fluor610 (9) 、在室温下搅拌混匀16小时； (10) 、使用S印hadex G25层析柱用0. 2M NaHC03pH9. 0溶液对步骤（9)制备的液体进 行脱盐处理，将收集液用0. 2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2. 5ml，得到二号过滤 液； (11) 、配置lOOmlO. 01M的ρΗ7· 2的PBS，然后向PBS中添加2g的BSA，向PBS中添加 0. 3g的吐温20 (TWEEN-20)，向PBS中添加0. 04g的casein，得到制备液； (12) 、将步骤（5)所得的液体按照1份一号过滤液：1500份制备液的比例添加到步骤 (11)制备的液体中，将步骤（10)所得的液体按照1份二号过滤液：500份制备液的比例添 加到步骤（11)制备的液体中，即得HS-CRP检测缓冲液。 所述的HS-CRPID芯片采用以下步骤制成： 将HS-CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得 HS-CRP ID 芯片。
2. 按照权利要求1所述的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于： 所述HS-CRP ID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度分别为0、1. 0、2. 0、4. 0、8. 0、 10.0 μ g/ml〇
3. 按照权利要求2所述的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于： 所述室温的温度为202-24°C。
4. 如权利要求1或2或3所述的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的检测方 法，其特征在于：包括如下步骤： 1) 、将10 μ 1的样本加入500 μ 1的所述检测缓冲液中，充分混匀； 2) 、取60 μ 1混合液，加入到HS-CRP反应板的测试区，反应3分钟； 3) 、将HS-CRP反应板放入荧光检测仪中，插入ID卡，仪器自动测量并出结果报告。
【文档编号】G01N33/558GK104122397SQ201310151166
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月27日 优先权日:2013年4月27日
【发明者】鄢盛恺 申请人:北京豪迈生物工程有限公司