专利名称：血清中3,5,3’-三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法
技术领域：
本发明涉及一种血清中3，5，3’-三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法，属于临床血液免疫检测方法技术领域。
背景技术：
3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸(T3)是甲状腺分泌的一种重要的甲状腺激素。血液循环中的T3除小部分由甲状腺组织直接释放外，大部分由甲状腺素(T4)脱碘转化而来。T3与T4同受下丘脑-垂体-甲状腺轴的调节，并协同维持甲状腺功能，对机体的生长、发育、代谢及全身激素的平衡起重要的调节作用。血清中总T3量只有T4的1/60，但其生物学活性比T4大5倍。T3是诊断甲亢最灵敏的指标之一，它可以特异性地反映甲状腺的功能状态，对判断甲状腺功能紊乱(如甲亢或甲减)有较高的应用价值。长期以来，临床医生是根据酶免疫分析或放射免疫分析检测结果来判断甲亢或甲减患者的病情。但是这两种方法分别有其缺点，如放射免疫分析操作复杂，时间长，有放射性污染问题，而酶免疫分析灵敏度低，检测范围窄等；由于夹心法成本较高，稳定性不好，且目前国内外没有配对的抗体，故不能使用夹心法进行检测；而化学发光方法能够提高检测的灵敏度，但是由于传统的化学发光底物液是由A液(氧化剂)和B液(发光剂)二部分组成，A液和B液分开保存，使用时将A液和B液等体积混合，而且要在10分钟之内用完，否则其稳定性就会变差，所以也会导致测试信号值急剧下降、检测范围明显变窄，稳定性变差，不便于临床应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种血清中3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法，使得检测 灵敏度和检测范围得到大幅度提高，提高了检测稳定性，为产品的大规模生产和临床应用带来更大的方便性和灵活性。本发明的目的是这样实现的:
一种血清中3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法，包括以下流程:
步骤一、T3标准品制备
取I 2mg的T3原料溶解于Iml 二甲基甲酰胺中，然后以去激素血清，将T3原料稀释成 0、0.75、1.5、3、6、12nmol/L—系列浓度；
步骤二、酶标记物的制备
取HRP (辣根过氧化物酶)3 4mg溶于Iml蒸懼水中，加入过碘酸钠0.1 0.5mg,混匀后室温放置30分钟，然后加入200微升的乙二醇，4°C放置30分钟；将lmgT3抗体(抗体用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS稀释至lmg/mL)加入到上述溶液中，混匀后装入透析袋用PH 9.16的CB (碳酸盐缓冲液)缓冲液于4°C透析过夜；取出透析袋中的液体，加入200ng的硼氢化钠，用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS透析，中间换1-2次水；透析完成后，取出液体置于离心管中，并加入同等于标记物量的丙三醇和BSA备用；步骤三、酶标记物稀释液的制备
以0.lmol/L pH7.0 8.0的Tris-HCl缓冲液为稀释液，加入1%甘油、2%甘露醇、0.5%酪蛋白和1%BSA以及的0.2%阻断剂(ANS)；
步骤四、包被抗原成为预包被反应板
将T3抗原以0.3μ g/ml置于设定的包被液(NaHCO3)中，加到微孔板(100 150 μ L/孔)，盖好封板膜，置于37°C温育6小时；取出恢复至室温后，甩掉微孔板内液体，拍干微孔板；然后加封闭液(PBS) (15(^17孔)，41:封闭过夜，真空包装后于41:保存；
五、发光底物液的制备
发光底物液:4_轻基联苯0.3mmol/L, 4-碘代苯基硼酸0.05 mmol/L,鲁米诺10 mmol/L，0.2mol/L硼酸液缓冲液pH8.7，过氧化脲0.lg/L，二甲基甲酰胺(DMF) 5ml/L，聚乙二醇600 (PEG-600) 1.5g/L，硫酸庆大霉素40万单位/L ；
六、浓缩洗液的制备在0.5M pH7.4 8.0的IOOOml磷酸盐缓冲液中加15 20ml的吐温_20、40g氯化钠、4g氯化钾、IOg蔗糖和10 15ml PC300，然后搅拌均匀；使用时40倍稀释；
具体检测步骤:
A、向预包被反应板的微孔中，加入样品和浓度分别为0、0.75,1.5、3、6、12nmol/L的标准品各50 μ I ;然后在上述孔内再加入50 μ I的检测Τ3的酶标记物，于37°C恒温温育30分钟，之后再用稀释了 40倍的浓缩洗液洗孔5次，最后甩干；
B、在上述孔中均加入发光底物液50μ 1，混匀后放置10分钟；
C、采用化学发光免疫分析系统软件测定包被板上述孔中的RLU值，对其分析，得到Τ3检测结果。与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明血清中3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法在酶免疫分析基础上结合了化学发光技术使得检测灵敏度和检测范围得到大幅度提高，同时也改变了传统的化学发光底物液的局限性，不再把两种发光底物液进行混合后使用，而只使用一种发光底物液，使操作变的更简单，为产品的大规模生产和临床应用带来更大的方便性和灵活性。
具体实施例方式本发明血清中3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法，采用竞争法测定，包括以下流程:
一、Τ3标准品制备
取I 2mg的T3原料溶解于Iml 二甲基甲酰胺中，然后以去激素血清，将T3原料稀释成 0、0.75、1.5、3、6、12nmol/L 一系列浓度。二、酶标记物的制备
取HRP (辣根过氧化物酶)3 4mg溶于Iml蒸懼水中，加入过碘酸钠0.1 0.5mg,混匀后室温放置30分钟，然后加入200微升的乙二醇，4°C放置30分钟；将lmgT3抗体(抗体用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS稀释至lmg/mL)加入到上述溶液中，混匀后装入透析袋用PH 9.16的CB (碳酸盐缓冲液)缓冲液于4°C透析过夜；取出透析袋中的液体，加入200ng的硼氢化钠，用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS透析，中间换1-2次水；透析完成后，取出液体置于离心管中，并加入同等于标记物量的丙三醇和BSA备用。三、酶标记物稀释液的制备
以0.lmol/L pH7.0 8.0的Tris-HCl缓冲液为稀释液，加入1%甘油、2%甘露醇、0.5%酪蛋白和1%BSA以及的0.2%阻断剂(ANS)。四、包被抗原成为预包被反应板
将T3抗原以0.3μ g/ml置于设定的包被液(NaHCO3)中，加到微孔板(100 150 μ L/孔)，盖好封板膜，置于37°C温育6小时。取出恢复至室温后，甩掉微孔板内液体，拍干微孔板；然后加封闭液(PB S) (15(^17孔)，41:封闭过夜，真空包装后于41:保存。五、发光底物液的制备
发光底物液:4_轻基联苯0.3mmol/L, 4-碘代苯基硼酸0.05 mmol/L,鲁米诺10 mmol/L，0.2mol/L硼酸液缓冲液pH8.7，过氧化脲0.lg/L，二甲基甲酰胺(DMF) 5ml/L，聚乙二醇600 (PEG-600) 1.5g/L，硫酸庆大霉素40万单位/L。六、浓缩洗液的制备
在0.5M pH7.4 8.0的IOOOml磷酸盐缓冲液中加15 20ml的吐温_20、40g氯化钠、4g氯化钾、IOg蔗糖和10 15ml PC300，然后搅拌均匀；使用时40倍稀释。具体检测步骤:
1、向预包被反应板的微孔中，加入样品和浓度分别为0、0.75,1.5、3、6、12nmol/L的标准品各50 μ I ;然后在上述孔内再加入50 μ I的检测Τ3的酶标记物，于37°C恒温温育30分钟，之后再用稀释了 40倍的浓缩洗液洗孔5次，最后甩干；
2、在上述孔中均加入发光底物液50μ 1，混匀后放置10分钟；
3、采用化学发光免疫分析系统软件测定包被板上述孔中的RLU值，对其分析，得到Τ3检测结果。
权利要求
1.一种血清中3，5，3’-三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法，其特征在于所述测定方法包括以下流程: 步骤一、T3标准品制备 取I 2mg的T3原料溶解于Iml 二甲基甲酰胺中，然后以去激素血清，将T3原料稀释成 0、0.75、1.5、3、6、12nmol/L—系列浓度； 步骤二、酶标记物的制备 取HRP (辣根过氧化物酶)3 4mg溶于Iml蒸懼水中，加入过碘酸钠0.1 0.5mg,混匀后室温放置30分钟，然后加入200微升的乙二醇，4°C放置30分钟；将lmgT3抗体(抗体用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS稀释至lmg/mL)加入到上述溶液中，混匀后装入透析袋用PH 9.16 的CB (碳酸盐缓冲液)缓冲液于4°C透析过夜；取出透析袋中的液体，加入200ng的硼氢化钠，用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS透析，中间换1-2次水；透析完成后，取出液体置于离心管中，并加入同等于标记物量的丙三醇和BSA备用； 步骤三、酶标记物稀释液的制备 以0.lmol/L pH7.0 8.0的Tris-HCl缓冲液为稀释液，加入1%甘油、2%甘露醇、0.5%酪蛋白和1%BSA以及的0.2%阻断剂(ANS)； 步骤四、包被抗原成为预包被反应板 将T3抗原以0.3μ g/ml置于设定的包被液(NaHCO3)中，加到微孔板(100 150 μ L/孔)，盖好封板膜，置于37°C温育6小时；取出恢复至室温后，甩掉微孔板内液体，拍干微孔板；然后加封闭液(PBS) (15(^17孔)，41:封闭过夜，真空包装后于41:保存； 步骤五、发光底物液的制备 发光底物液:4_轻基联苯0.3mmol/L, 4-碘代苯基硼酸0.05 mmol/L,鲁米诺10 mmol/L，0.2mol/L硼酸液缓冲液pH8.7，过氧化脲0.lg/L，二甲基甲酰胺(DMF) 5ml/L，聚乙二醇.600(PEG-600) 1.5g/L，硫酸庆大霉素40万单位/L ； 步骤六、浓缩洗液的制备 在0.5M pH7.4 8.0的IOOOml磷酸盐缓冲液中加15 20ml的吐温_20、40g氯化钠、4g氯化钾、IOg蔗糖和10 15ml PC300，然后搅拌均匀；使用时40倍稀释； 具体检测步骤: A、向预包被反应板的微孔中，加入样品和浓度分别为0、0.75,1.5、3、6、12nmol/L的标准品各50 μ I ;然后在上述孔内再加入50 μ I的检测Τ3的酶标记物，于37°C恒温温育30分钟，之后再用稀释了 40倍的浓缩洗液洗孔5次，最后甩干； B、在上述孔中均加入发光底物液50μ 1，混匀后放置10分钟； C、采用化学发光免疫分析系统软件测定包被板上述孔中的RLU值，对其分析，得到Τ3检测结果。
全文摘要
本发明涉及一种血清中3,5,3’-三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法，包括T3标准品制备、酶标记物的制备和稀释、包被抗原成为预包被反应板、发光底物液的制备和浓缩洗液的制备等步骤。本发明血清中3,5,3’-三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法在酶免疫分析基础上结合了化学发光技术使得检测灵敏度和检测范围得到大幅度提高，同时也改变了传统的化学发光底物液的局限性，不再把两种发光底物液进行混合后使用，而只使用一种发光底物液，使操作变的更简单，为产品的大规模生产和临床应用带来更大的方便性和灵活性。
文档编号G01N33/78GK103217414SQ20131015129
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者奚伟红, 王布强, 王京, 高淑舫 申请人:江苏创生生物技术有限公司