专利名称：一种检测土壤中痕量井冈霉素a的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测土壤中痕量井R霉素A的方法，具体涉及一种利用大孔强酸性阳离子交换树脂富集土壤中井R霉素A，以缓冲溶液和乙醇除杂，再利用非极性大孔吸附树脂除去非极性杂质后采用常规反相柱进行痕量井R霉素A等度洗脱分析的方法，属于土壤中农药残留分析领域。
背景技术：
井冈霉素是我国独立开发研制的生物源杀菌剂，主要用于抑制水稻纹枯菌的生长，对蔬菜、棉花等其它农作物的立枯病也有很好的防治效果，是至今为止我国最廉价且使用面积最广的一种农用抗生素，是农民非常信赖的产品之一。井R霉素A是井R霉素中最具活性的物质，分子中含有多个极性基团，难于气化，不能直接进行气相色谱分析。由于井R霉素的吸光能力弱，其最大吸收波长为210 nm，在此波长下测定，基质中的杂质极易产生干扰，而荧光检测技术由于受到衍生条件的限制，重现性和再现性较差。张存政等(南京农业大学学报，2005，28(1): 107-110)将5 g新鲜稻叶以90%的甲醇提取，经C18固相萃取小柱净化后，在210 nm波长下，对水稻叶片中的井冈霉素残留量进行了分析，以2倍信噪比计算得井R霉素的最低检出量为0.46 ng，最低检出限为0.92 mg/kg。一方面，该法需要用比较昂贵的C18固相萃取小柱对样品溶液进行净化，另一方面，以甲醇:Na2HPO4 (pH=7) = 2: 98 (V: V)为流动相进行HPLC分析，经过C18固相萃取小柱净化的样品溶液中仍然有较多的极性较低的物质会残留在色谱分析柱上，污染分析柱。马婧玮等(农药，2007，46(10): 686-687)采用 Venusil HILIC 柱，在 210 nm波长下，以乙腈-水为流动相，建立了井R霉素A的反相高效液相色谱梯度洗脱分析方法，方法的精密度高，但需要用高含量的乙腈。余晓江等(现代农药，2011，10(2): 37-39)将大米和谷壳分别以10%的氨水 和90%的甲醇提取，经C18固相萃取小柱净化后，在亲水C18柱上，以210 nm为检测波长，对大米和谷壳中的井冈霉素残留量进行了分析，井冈霉素的最低检出量为0.5 ng,大米和谷壳中井R霉素的最低检测浓度均为0.2 mg/kg。关文碧等(分析科学学报，2012，28(4): 136-138)以90%甲醇为提取溶剂，采用HPLC-MS/MS法测定了稻米和谷壳中的井冈霉素残留量，虽然灵敏度很高，定量限为0.005 mg/kg，但必须要使用液质联用仪。上述分析方法中，有的需要使用大量昂贵的色谱试剂乙腈，有的必须要经过一次性的固相萃取小柱进行样品净化，有的则必须要用液质联用仪，成本非常高。为此，需要一个成本低廉且不需要使用大量有毒试剂的、对痕量井R霉素A进行富集、净化和测定的方法。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种检测土壤中痕量井R霉素A的方法。本发明提供了一种检测土壤中痕量井R霉素A的方法，具体操作步骤如下:(1)提取:称取40.0 g含有0.05 1.00 mg/kg井冈霉素的土壤样品，以40 mL缓冲溶液超声提取15 min后,经过布氏漏斗减压抽滤或离心15 min,再分别用30 mL、30 mL缓冲液洗漆残洛、抽滤瓶或离心管，合并清液，用盐酸或氢氧化钠调节提取液的pH值；
(2)富集:量取30mL经过预处理的阳离子交换树脂于玻璃层析柱中，以60 mL pH 3.5的磷酸盐缓冲液平衡后，将提取液上样于层析柱中进行吸附富集；
(3)去杂:分别用pH3.5的磷酸盐缓冲溶液和乙醇淋洗去除杂质；
(4)洗脱:用6(T175mL洗脱剂进行洗脱；
(5)净化:将步骤(4)的洗脱液以不高于60°C的温度，在旋转蒸发仪上浓缩至约30mL，加入10 g左右非极性大孔吸附树脂振摇，过滤，用20 mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤树脂2次，过滤，合并滤液，在60°C下旋蒸近干，再用氮气或空气吹干，定量加入2.00 mLNa2HPO4-KH2PO4缓冲溶液(ρΗ7.0)超声溶解；
(6)检测:将样品溶液按下述色谱操作条件进行检测=LC-1OAtvp型高效液相色谱仪(日本岛津公司生产，带液相色谱工作站和紫外检测器)，色谱柱:Aligent C18 plus柱(4.6 X 250 mm, 5Mm)，流动相:甲醇=Na2HPO4-KH2PO4 缓冲溶液(ρΗ7.0) = 2:98 (V:V)，流速:0.6 mL/min，检测波长:210 nm，柱温:35°C，进样量:20 μ L ;
(7)回收:将使用过的阳离子交换树脂和非极性树脂经过5%HCl和5% NaOH处理后回收再利用。步骤(I)中所述的缓冲溶液为浓度0.05、.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，pH值为
6.0 9.0 ;离心速度为3000^15000 r/min ;清液的pH值为2.5 7.5。步骤(2)中所述的阳离子交换树脂为D072大孔强酸性阳离子交换树脂(南开和成科技有限公司，使用前用4%HCl、4%NaOH和乙醇预处理)，提取液上样速度为0.3^1.0 mL/min。步骤(3)中所述pH 3.5磷酸盐缓冲溶液浓度为0.θΓθ.1 mol/L,所用体积为60 200 mL,乙醇体积为60 200 mL,淋洗速度为0.5 1.0 mL/min。步骤(4)所述洗脱剂是选自以下溶剂中的一种:1 mol/L氨水，1.5 mol/L氨水,2mol/L氨水，I mol/L氨水:乙醇=1: 1，2: 1，3:1和4:1 (均为体积比)，洗脱速度为0.5 1.0mL/minο步骤(5)中所述的非极性大孔吸附树脂为x-5 (南开和成科技有限公司，使用前用5%HCl、5%Na0H、丙酮和乙醇预处理)，振摇时间为20 mirTl h。技术效果:
1.本发明方法中所用D072树脂和X-5树脂非常便宜，在井R霉素的富集、除杂、洗脱和净化过程中不需要使用有毒的试剂；
2.本发明方法操作简单，不需要使用昂贵的一次性固相萃取小柱进行样品净化或液质联用仪器可以在普通的反相液相色谱柱上实现井网霉素的等度洗脱，既节约了成本，又避免了梯度洗脱造成的基线漂移；
3.本发明的准确度高，精密度好，检测限低。稻田土壤的空白添加回收率在70.359Γ96.44%之间，相对标准偏差为7.1% 9.8%，最低检出限为0.01 mg/kg。井冈霉素添加回收率和相对标准偏差均在农药残留试验准则允许的范围内，符合农药残留量分析与检测的技术要求，可以应用于土壤中痕量井网霉素A的分析检测。
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图1是井网霉素A标样色谱图，Y为井网霉素A锋；
图2是稻田土壤空白色谱 图3是稻田土壤添加未经X-5净化的色谱图，Y为井R霉素A锋；
图4是稻田土壤添加经过X-5净化后的色谱图，Y为井R霉素A锋。
具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。供试土壤:供试土壤为潮土、红壤和紫色土 3种土壤。其pH值和有机质含量分别% 6.2,2.13%、6.5，2.32% 和 6.2，2.02%。实施例1:
称取河潮土空白样品40.0 g于250 mL具塞三角瓶中，准确加入井冈霉素标准溶液，使其在土壤中的添加浓度为0.05 mg/kg，加入40 mL Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液(ρΗ7.0)超声提取15 min,离心(15000 r/min) 15min,再分别用30 mL、30 mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤残渣和离心管，合并清液，用稀盐酸和氢氧化钠调节至PH 3.5后，以0.3 mL/min的速度上样于D072柱。依次用150 mL磷酸盐缓冲溶液(ρΗ3.5)和125 1^乙醇以0.6 mL/min的淋洗速度淋洗去 除杂质，用100 mL I mol/L氨水:乙醇=4:1洗脱，收集洗脱液，在60°C下旋蒸浓缩至约30 mL,加入10 g左右X-5树脂振摇30 min,过滤,再用20 mL pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤树脂2次，过滤，合并滤液，浓缩至近干，用氮气或空气吹干，定量加入2.00mL Na2HPO4-KH2POJ^冲溶液(PH7.0)超声溶解，按步骤(6)所述色谱操作条件进行HPLC检测。5次平行测定的回收率分别为:72.64%、78.57%、76.13%、87.27%和82.02%，平均回收率为79.33%，相对标准偏差为7.1%。井冈霉素标样色谱图见图1，稻田土壤空白色谱图见图2，稻田土壤添加未经X-5净化的色谱图见图3 ;稻田土壤添加经过X-5净化后的色谱图见图4。实施例2:
称取红壤土空白样品40.0 g于250 mL具塞三角瓶中，准确加入井冈霉素标准溶液，使其在土壤中的添加浓度为0.50 mg/kg，加入40 mL Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液(ρΗ7.0)超声提取15 min,离心(15000 r/min) 15min,再分别用30 mL、30 mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤残渣和离心管，合并清液，用稀盐酸和氢氧化钠调节至PH 3.5后，以0.8 mL/min的速度上样于D072柱。依次用150 mL磷酸盐缓冲溶液(ρΗ3.5)和125 1^乙醇以0.6 mL/min的淋洗速度淋洗去除杂质，用100 mL I mol/L氨水:乙醇=4:1洗脱，收集洗脱液，在60°C下旋蒸浓缩至约30 mL,加入10 g左右X-5树脂振摇40 min,过滤,再用20 mL pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤树脂2次，过滤，合并滤液，浓缩至近干，用氮气或空气吹干，定量加入2.00mL Na2HPO4-KH2POJ^冲溶液(PH7.0)超声溶解，按步骤(6)所述色谱操作条件进行HPLC检测。5次平行测定的回收率分别为:92.11%、78.97%、87.17%、76.63%和96.44%，平均回收率为86.26%，相对标准偏差为9.8%。实施例3:
称取紫色土空白样品40.0g于250 mL具塞三角瓶中，准确加入井R霉素标准溶液，使其在土壤中的添加浓度为1.00 mg/kg，加入40 mL Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液(ρΗ7.0)超声提取15 min，减压抽滤，再分别用30 mL、30 mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤残渣和抽滤瓶，合并滤液，用稀盐酸和氢氧化钠调节至pH 3.5后，以0.6 mL/min的速度上样于D072柱。依次用150 mL磷酸盐缓冲溶液(pH3.5)和125 mL乙醇以0.6 mL/min的淋洗速度淋洗去除杂质，用100 mLl mol/L氨水:乙醇=4:1洗脱,收集洗脱液,在60°C下旋蒸浓缩至约30 mL,加入10 g左右X-5树脂振摇I h，过滤，再用20 mL pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤树脂2次，过滤，合并滤液，浓缩至近干，用氮气或空气吹干，定量加入2.00 mL Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液(PH7.0)超声溶解，按步骤(6)所述色谱操作条件进行HPLC检测。5次平行测定的回收率分别为:78.19%、87.80%、70.35%、78.30%和79.05%，平均回收率为78.74%，相对标准偏差为 7.9%
权利要求
1.本发明提供了一种检测土壤中痕量井R霉素A的方法，具体操作步骤如下: (1)提取:称取40.0 g含有0.05 1.00 mg/kg井冈霉素的土壤样品，以40 mL缓冲溶液超声提取15 min后,经过布氏漏斗减压抽滤或离心15 min,再分别用30 mL、30 mL缓冲液洗漆残洛、抽滤瓶或离心管，合并清液，用盐酸或氢氧化钠调节提取液的pH值； (2)富集:量取30mL经过预处理的阳离子交换树脂于玻璃层析柱中，以60 mL pH 3.5的磷酸盐缓冲液平衡后，将提取液上样于层析柱中进行吸附富集； (3)去杂:分别用pH3.5的磷酸盐缓冲溶液和乙醇淋洗去除杂质； (4)洗脱:用6(T175mL洗脱剂进行洗脱； (5)净化:将步骤(4)的洗脱液以不高于60°C的温度，在旋转蒸发仪上浓缩至约30mL，加入10 g左右非极性大孔吸附树脂振摇，过滤，用20 mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤树脂2次，过滤，合并滤液，在60°C下旋蒸近干，再用氮气或空气吹干，定量加入2.00 mLPH7.0的Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液超声溶解； (6)检测:将样品溶液按下述色谱操作条件进行检测=LC-1OAtvp型高效液相色谱仪，色谱柱=Aligent C18 plus柱，流动相:甲醇:pH7.0的Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液体积比2:98，流速:0.6 mL/min，检测波长:210 nm，柱温:35°C，进样量:20 μ L ; (7)回收:将使用过的阳离子交换树脂和非极性树脂经过5%HCl和5% NaOH处理后回收再利用。
2.根据权利要求1的方法，步骤(I)中所述的缓冲溶液为浓度0.05、.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，pH值为6.0 9.0 ;离心速度为3000^15000 r/min ;清液的pH值为2.5 7.5。
3.根据权利要 求1的方法，步骤(2)中所述的阳离子交换树脂为D072大孔强酸性阳离子交换树脂，提取液上样速度为0.3^1.0 mL/min。
4.根据权利要求1的方法，步骤(3)中所述pH3.5磷酸盐缓冲溶液浓度为0.0Γ0.1mol/L，所用体积为60 200 mL，乙醇体积为60 200 mL，淋洗速度为0.5 1.0 mL/min。
5.根据权利要求1的方法，步骤(4)所述洗脱剂是选自以下溶剂中的一种:1mol/L氨水，1.5 mol/L氨水,2 mol/L氨水，I mol/L氨水:乙醇=1:1, 2:1, 3:1和4:1 (均为体积比)，洗脱速度为0.5 1.0 mL/min。
6.根据权利要求1的方法，步骤(5)中所述的非极性大孔吸附树脂为X-5，使用前用5%HCl、5%Na0H、丙酮和乙醇进行预处理，振摇时间为20 mirTl h。
全文摘要
本发明公开了一种属于土壤中农药残留分析领域的利用大孔强酸性阳离子交换树脂和非极性大孔树脂检测土壤中痕量井冈霉素A的方法。该方法采用缓冲溶液提取土壤中的井冈霉素A，以大孔强酸性阳离子交换树脂D072吸附井冈霉素A，然后以缓冲溶液和乙醇除杂，再利用非极性大孔吸附树脂除去非极性杂质后采用常规反相柱进行痕量井冈霉素A的等度洗脱分析，从而实现对土壤中痕量井冈霉素A的检测。本发明方法分别采用价格便宜的D072树脂和X-5为吸附和净化材料，不仅操作简单，避免了有毒有机溶剂的反复萃取和昂贵的一次性固相萃取小柱的样品净化，也不需要液质联用仪器便可以在普通的反相液相色谱柱上实现井冈霉素A的等度洗脱，既节约了成本，又避免了梯度洗脱造成的基线漂移。准确度高，回收率在70.35%~96.44%之间，精密度好，5次平行测定的相对标准偏差为7.1%~9.8%，最低检限为0.01mg/kg。
文档编号G01N30/06GK103235065SQ201310181728
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月17日 优先权日2013年5月17日
发明者石国荣 申请人:向华