一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用，属于疾病的诊断和检测【技术领域】。本发明一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有分别偶联了PCT单克隆抗体以及PCT多克隆抗体的不同粒径大小的羧基化的聚苯乙烯胶乳。使用本发明的方法分别对PCT单克隆抗体和PCT多克隆抗体进行标记后，得到的大粒径胶乳可以提高检测灵敏度，小粒径胶乳可以拓宽线性范围，因此，本发明的复合胶乳制剂既可以提高检测灵敏度，又可拓宽检测线性范围，对降钙素原的检测来说具有检测快速、敏感度高、特异性强和准确性好等优点。
【专利说明】-种用于测定降巧轰原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制 备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用，特别涉及一种 用于测定降巧素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用，本发明属于疾病的诊 断或检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 降巧素原（PCT)是无激素活性的降巧素前肤物质，由116个氨基酸组成，分子量为 13KD的糖蛋白。PCT的半衰期为25-30小时，在体外稳定性很好。
[0003] PCT来自定位于第11号染色体上（11P15,4)的单拷贝基因（与降巧素基因相关 肤为同一基因）。该基因由2800个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子，基因全长约 7. 6肺。转录后经特定剪接产生PCTmRNA,再翻译成降巧素原前体（Pre-PCT),在高尔基复合 体及分泌囊中，经一系列水解酶作用最终形成PCT氨基酸多肤（aminoPCT)，降巧素（CT)及 駿基端21个氨基多肤（CT =CCP-I )。
[0004] 正常条件下人血清PCT含量极低，约2. 5pg/ml (运用高效液相色谱分析)，而成熟 CT含量约6.化g/ml。髓质甲状腺肿瘤或其他神经内分泌肿瘤患者血清PCT及其组分均增 高，组分相对含量也发生变化。在一些非甲状腺损伤如慢性肾衰、吸入性烧伤、急性细菌感 染、中风、败血症等患者血清PCT及其组分也均增高，有些甚至成倍的上升，而CT略微升高， 说明除甲状腺髓质细胞分泌胆存PCT外，仍有其他细胞具有该些功能。
[0005] PCT选择性地对系统性细菌感染、真菌感染及寄生虫感染有反应，而对无菌性炎症 和病毒感染无反应或仅有轻度反应。许多学者研究发现，全身性细菌、真菌和寄生虫感染 时，PCT水平异常增高，增高的程度与感染的严重程度及预后相关，在全身性细菌感染和賊 毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值。PCT水平的监测，对于严 重威胁生命的感染性疾病过程和跟踪治疗方案是很有用的，PCT浓度的升高标志着炎症反 应正在进行中，使用足够的抗生素、炎症灶清除术治疗等，PCT值下降，证明治疗方案正确， 预后良好，反之改变治疗方案。
[0006] PCT为所有不知病因的炎症性疾病的鉴别诊断提供帮助与支持，如细菌性与毒素 性的急性成人呼吸窘迫综合症(ARDS)的鉴别；胆源性与毒素性膜腺炎的鉴别；细菌性与病 毒性脑膜炎的鉴别；微生物诱导的发热与非细菌性发热的鉴别，特别是发热待查（FOU)的 诊断，病毒感染或自身免疫失调与免疫抑制条件下的急性细菌感染的鉴别，发热的病因的 鉴别，如在肿瘤患者中被肿瘤溶解物或化疗诱导与细菌、真菌或其他感染病因区别，早期诊 断新生儿和婴儿全身性细菌感染与败血症引起的急性发热；术后常规，包括术后感染预警 及用药监测，术后切除感染灶巧日腹膜炎、软组织感染）后的治疗指导，监测腹膜炎、吻合口 漏和无典型腹部症状的疾病过程；器官移植后的监测，移植前排除急性细菌或其他感染，鉴 别急性器官排斥、急性病毒、细菌与真菌感染；长期在ICU的患者及长期机械通气患者的监 巧IJ，监测疾病过程及指导治疗；监测高危患者，早期获得有关并发症和内环境衰退的信息。
[0007] 许多临床研究证明，PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前 所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息。随 着临床实践性研究的不断深入，临床数据的不断积累，PCT作为一个全身性细菌感染和賊毒 症辅助和鉴别诊断的常规指标将成为共识，并将得到广泛的应用。
[0008] 目前，检测PCT较特异与敏感的分析方法有：双抗夹也免疫化学发光法(双抗夹也 法）和放射免疫分析法（RIA)。
[0009] 双抗夹也法运用双单克隆抗体，其一作为捕获抗体直接结合PCT96-106氨基酸 残基即未成熟CT =CCP-I部分，另一作为示踪抗体直接结合PCT70-76氨基酸残基，即未 成熟CT分子，人工合成的PCT作为标准。该方法比较特异无交叉反应，其检测最低为 IOpg'11^-11，标准曲线线性范围为10-6化g'11^-1。批内、批间变异系数分别为7 %和8 %。 该法已有商品试剂，所需时间较短，易自动化，但该法不能检测到正常人血清中PCT。
[0010] RIA使用一种对人工合成的aminoPCT特异的多克隆抗体RIB7。RIB7直接作用PCT 的aminoPCT部分，故RIA既能检测游离的PCT，又能检测结合型的PCT，也可检测降巧素基 因相关前体（Pro-CGRP),此法可信的敏感度为4pg -ml-1。线性范围10-77pg -ml-1,50 % 的结合游离比为14化g ?na-l，该法能检测正常人血清PCT，故较双抗夹也法敏感，另一优点 是RIA与患者病程呈现正相关（r=0. 47, P=O. 071)。但是RIA的缺点是所需时间较长。
【发明内容】
[0011] 针对现有技术中的问题，本发明提出了一种用于测定降巧素原的胶乳增强免疫比 浊试剂盒及其制备方法和应用，本发明所建立的用于测定降巧素原的胶乳增强免疫比浊试 剂盒采用免疫比浊法，W乳胶增强免疫比浊法为测定原理可实现对降巧素原快速且准确的 检测。
[0012] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为：
[0013] 本发明公开了一种用于测定降巧素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于所 述的试剂盒包括稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有 分别偶联了 PCT单克隆抗体W及PCT多克隆抗体的不同粒径大小的駿基化的聚苯己帰胶 乳。
[0014] 在本发明中，优选的，偶联了 PCT单克隆抗体的駿基化的聚苯己帰胶乳的粒径为 76nm，偶联了 PCT多克隆抗体的駿基化的聚苯己帰胶乳的粒径的187nm。
[00巧]在本发明中，优选的，所述的稀释液为含有2M化Cl，2% (w/w)PEG20000,0. 5%(w/ w) BSA，0. P/o (w/w) proclin-300 的 0. 05M Tris-HCL 缓冲液，pH=8. 4。
[0016] 在本发明中，优选的，所述的胶乳制剂是按照W下方法制备得到的：
[0017] (1)駿基化的聚苯己帰胶乳活化
[001引 lOmg/ml的駿基化的聚苯己帰胶乳Iml中加入50mM，P册.IMES溶解的Img邸C (1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐)和IOmgNHS (N-轻基玻巧醜亚胺)混匀活 化60分钟，离也8000巧m弃去上清，沉淀用PH7. 4的50mM PBS重息；按照上述方法分别制 备得到了粒径为76nm和187nm活化后的駿基化的聚苯己帰胶乳；
[0019] (2)偶联了 PCT单克隆抗体的駿基化的聚苯己帰胶乳的制备
[0020] 将Img PCT单克隆抗体加入2ml浓度为lOmg/ml的粒径为76皿胶乳溶液中，室温 混匀2-4小时，2-8°C SOOOiDm离也15min，收集上清液备用，加入含有5mg BSA的50mM PBS, 室温混匀1-2小时；2-8°C 8000巧m离也15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸， 充分混匀30min ;2-8°C 8000巧m离也15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复 融胶乳；
[0021] (3)偶联了 PCT多克隆抗体的駿基化的聚苯己帰胶乳的制备
[002引将0. 5mg PCT多克隆抗体加入2ml浓度为lOmg/ml的粒径为187皿的胶乳溶液中， 室温混匀2 - 4小时，2-8C 800化pm离也15min，收集上清液备用，加入含有2. 5m浊SA的 50mM PBS，室温混匀1-2小时；2-8°C 8000巧m离也15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM 的甘氨酸，充分混匀30min ;2-8°C 8000巧m离也15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-肥1 缓冲液复融胶乳；
[0023] ( 4 )将两种胶乳溶液进行混合。
[0024] 在本发明中，优选的，步骤（4)中，是将两种粒径的胶乳试剂进行体积比1 ;1混合， 充分混匀后备用。
[0025] 在本发明中，优选的，所述的缓冲液为含有1% (w/w化SA，0. 05% (v/v)吐温，0. 1% (w/w)海藻糖、0. Ig/L駿甲基纤维素轴，0. l%(w/w)NaN3 的 0. 05M Tris-HCl 缓冲液，pH=7. 4。
[0026] 本发明在胶乳试剂中加入駿甲基纤维素轴，增加了胶乳分散性，加入海藻糖，增加 胶乳的蛋白稳定性。
[0027] 在本发明中，优选的，所述的空白液为0.05M PBS磯酸缓冲液。
[0028] 在本发明中，优选的，所述的校准品包括降巧素原浓度分别为0、0. 1、0. 5、2. 5、10、 3〇y g/L的校准品。
[0029] 在本发明中，优选的，所述的质控品中降巧素原的浓度为0. 21-0. 29 U g/L。
[0030] 更进一步的，本发明提出了所述的试剂盒在制备检测降巧素原试剂中的应用。
[0031] 本发明试剂盒的使用方法：
[003引采用免疫比浊法，W乳胶增强免疫比浊法为测定原理。样品中的PCT与标记了 PCT 抗体的乳胶颗粒发生特异性的抗原抗体反应，形成免疫复合物，从而引起吸光度的变化。此 吸光度的变化与样品中的PCT浓度呈正比。用已知浓度的PCT校准品制作工作曲线，从该 曲线上即可计算出样品中的PCT含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为使用本发明的校准品制备得到的标准曲线。
【具体实施方式】
[0034] 下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，该些实施例 仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利 要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明 的保护范围内。
[00巧]本发明实施例所涉及主要材料及试剂的购买来源：
[0036] PCT抗原、抗体均购自杭州启泰生物；
[0037] EDC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐)、N服（N-轻基玻巧醜亚胺)、 proclin-300 购自 SIMGA ;
[0038] 聚苯己帰胶乳购自美国Bangs ;
[0039] 其他的无机盐试剂及PEG20000,駿甲基纤维素轴等均购自国药试剂。
[0040] 实施例1本发明的一种用于测定降巧素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备
[00川 1、试剂配置
[0042] 1.1、稀释液Rl配制
[0043] 配方；0. 05M Tris-HCl 缓冲液，含有 2M 化Cl，2% (w/w)PEG20000,5% (w/w化SA, 0.1% (w/w)proclin-300, pH=8. 4
[0044] I. 2、胶乳试剂R2的配制
[0045] (I)駿基化的聚苯己帰胶乳活化
[0046] lOmg/ml的駿基化的聚苯己帰胶乳Iml中加入50mM, P册.IMES溶解的Img邸C (1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐）和IOmg N服（N-轻基玻巧醜亚胺）混匀 活化60分钟，离也8000巧m弃去上清，并用50mM PBS重息；按照上述方法分别制备得到了 粒径为76nm和187nm活化后的駿基化的聚苯己帰胶乳；
[0047] (2)偶联了 PCT单克隆抗体的駿基化的聚苯己帰胶乳的制备
[004引将Img PCT单克隆抗体加入2ml浓度为lOmg/ml的粒径为76皿胶乳溶液中，室温 混匀4小时，4°C 8000巧m离也15min，收集上清液备用，加入含有5mg BSA的50mM PBS，室 温混匀2小时；4C 8000巧m离也15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸，充分混 匀30min ;4°C 800化pm离也15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融胶乳；
[0049] (3)偶联了 PCT多克隆抗体的駿基化的聚苯己帰胶乳的制备
[0050] 将0. 5mg PCT多克隆抗体加入2ml浓度为lOmg/ml的粒径为187皿的胶乳溶液 中，室温混匀4小时，4°C 800化pm离也15min，收集上清液备用，加入含有2. 5m浊SA的50mM PBS，室温混匀2小时；4°C 8000巧m离也15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸， 充分混匀30min ;4°C 8000巧m离也15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融 胶乳；
[0051] 所述的缓冲液为含有1% (w/wWSA,0. 05% (v/v)吐温，0. 1% (w/w)海藻糖、0. Ig/ L駿甲基纤维素轴，0. 1% (w/w) NaN3的0. 05M Tris-肥L缓冲液，pH=7. 4。
[0052] (4)将两种粒径的胶乳试剂进行体积比1 ;1混合，充分混匀后备用。
[0053] 1. 3、标准品稀释液的配制
[0054] 0. 05M PBS 缓冲液 [00巧]1.4、标准品的配制
[0056] W进口的罗氏公司降巧素原标准品为基准，使用混合后的胶乳试剂连续测试20 次后取平均值，然后使用标准品稀释液稀释人降巧素原重组蛋白（购自杭州启泰生物）与罗 氏公司标准品一致。
[0057] 1. 5、校准品及质控品配制
[0058] 取大小合适的容器7个，使用标准稀释液稀释含有人降巧素原重组蛋白的标准品 配制浓度点依次为〇、〇. 1、〇. 5、2. 5、10、30y g/L的校准品各点，W及人降巧素原重组蛋白 浓度为0. 21-0. 29 y g/L的质控品，各浓度点要使依次加入的原料浓溶液混匀。
[0059] 质控品的目的：在校准完成W后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之内， 如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。
[0060] 2、确定稀释倍数
[0061] 取抗体标记剩余上清液体分别用0D260和0D280测量其吸光度值，利用测量结果 并根据一下公式计算剩余上清液中抗体的浓度和标记效率；最后根据标记抗体量确定稀释 倍数。
[0062] 抗体浓度=1. 45*A280-0. 74*A260
[0063] 标记抗体量=标记总蛋白量-上清中蛋白量
[0064] 标记效率=(标记总蛋白量-上清中蛋白量）/标记总蛋白量*100%
[0065] 通过测量计算出单克隆抗体标记量为0. 886mg，故标记效率为88. 6% ;
[0066] 通过测量计算出多克隆抗体标记量为0. 459mg，故标记效率为91. 8%。
[0067] 3、胶乳颗粒稀释
[0068] 按照抗体过量原则，根据已定所需标记抗体浓度用缓冲液对标记的抗体进行稀 释。对浓缩胶乳颗粒进行1 ;8、1 ;9、1 =IOH个比例进行稀释，分别测量配置完成的校准品， W线性最好且线性范围最大的稀释比例为最佳，通过检测选择的为1 ;1〇的比例进行稀释。 [006引 4、分装
[0070] 将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2?8C保存。经检验 合格后，将配制好的校准品和质控品分装到Iml塑料瓶中，1. Oml/瓶。本发明试剂盒的主要 组成成份如表1所示：
[0071] 表1本发明试剂盒的主要组成成份
【权利要求】
1. 一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括 稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有分别偶联了 PCT 单克隆抗体以及PCT多克隆抗体的不同粒径大小的羧基化的聚苯乙烯胶乳。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，偶联了 PCT单克隆抗体的羧基化的聚苯乙 烯胶乳的粒径为76nm，偶联了 PCT多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径为187nm。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的稀释液为含有2M NaCl，2% (w/w) PEG20000,0. 5% (w/w) BSA，0. 1% (w/w) proclin-300 的 0· 05M Tris-HCl 缓冲液，ρΗ=8· 4。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的胶乳制剂是按照以下方法制备得到 的： (1) 羧基化的聚苯乙烯胶乳活化 10mg/ml的羧基化的聚苯乙烯胶乳lml中加入50mM，ΡΗ6. 1MES溶解的lmg EDC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和lOmgNHS (N-羟基琥珀酰亚胺)混匀活 化60分钟，离心8000rpm弃去上清，沉淀用PH7. 4的50mM PBS重悬；按照上述方法分别制 备得到了粒径为76nm和187nm活化后的羧基化的聚苯乙烯胶乳； (2) 偶联了 PCT单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备 将lmg PCT单克隆抗体加入2ml浓度为10mg/ml的粒径为76nm胶乳溶液中，室温混勻 2-4小时，2-8°C 8000rpm离心15min，收集上清液备用，加入含有5mg BSA的50mM PBS，室温 混勻1-2小时；2-8°C 8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸，充 分混勻30min ;2-8°C 8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融 胶乳； (3) 偶联了 PCT多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备 将0. 5mg PCT多克隆抗体加入2ml浓度为10mg/ml的粒径为187nm的胶乳溶液中，室 温混匀2 - 4小时，2-8°C 8000rpm离心15min，收集上清液备用，加入含有2. 5mgBSA的50mM PBS，室温混匀1-2小时；2-8°C 8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘 氨酸，充分混勻30min ;2-8°C 8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓 冲液复融胶乳； (4) 将两种胶乳溶液进行混合。
5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于步骤（4)中，是将两种粒径的胶乳试剂进行 体积比1 :1混合，充分混匀后备用。
6. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于步骤（2)或步骤（3)中所述的缓冲液为含有 1% (w/w)BSA，0. 05% (v/v)吐温，0. 1% (w/w)海藻糖、0. lg/L 羧甲基纤维素钠，0. 1% (w/ w) NaN3 的 0· 05M Tris-HCl 缓冲液，ρΗ=7· 4。
7. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的空白液为0. 05Μ PBS磷酸缓冲液。
8. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的校准品包括降钙素原浓度分别为0、 0· 1、0· 5、2· 5、10、30μ g/L 的校准品。
9. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的质控品中降钙素原的浓度为 0.21-0. 29 μ g/L〇
10. 权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备检测降钙素原试剂中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK104237525SQ201310253612
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月24日 优先权日:2013年6月24日
【发明者】金鑫, 曾滨 申请人:北京美康生物技术研究中心有限责任公司