4H-[1]-苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及糖蛋白特异性荧光检测技术，具体地说是4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。本发明还提供了应用4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼进行糖蛋白特异性荧光检测的方法，包括步骤：将电泳后含蛋白质样品的凝胶在固定液中固定；高碘酸溶液氧化；乙酸水溶液冲洗；染色；洗脱。本发明具有灵敏度高、选择性好、操作简单迅速、重现性好、线性关系好、质谱兼容性好、使用安全、成本低廉等优点，可较好地适用于高通量蛋白质组学的研究。
【专利说明】4H-[1]-苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物 在糖蛋白特异性荧光检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及糖蛋白特异性荧光检测技术，具体地说是4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b] 噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍 的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这 些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化 对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附 等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但 目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也 占到较高的比例。
[0003] 目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于外国的生物试剂公司，且多数产品均以高 附加值的价格在市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现 有的生物试剂进行生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。本发明开 发的4H-[1]_苯并吡喃[4,3_b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物荧光染色方法灵敏度接近 Pro-Q Emerald488染色法，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧光检测技术，有较好的基础 与临床意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物 在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。
[0005] 本发明所述的4H-[1]_苯并吡喃[4,3_b]噻吩-2-甲酸酰肼相关化合物是指以 4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。
[0006] 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼母核为：
[0007]
【权利要求】
1.4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测 中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲 酸酰肼及其衍生物为4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的钠盐、钾盐或铵盐。
3. -种凝胶上糖蛋白特异性荧光检测方法，其包括步骤： 1) 将经SDS-PAGE电泳后含蛋白质样品的凝胶置于固定液中固定10?60min，弃固定 液； 2) 在高碘酸溶液里氧化10?40min，其中高碘酸溶液为含重量体积比0. 1?1%的高 碘酸及按体积比〇. 5?5%的乙酸水溶液。然后用按体积比0. 5?5%的乙酸水溶液冲洗 2?5次，每次1?lOmin ; 3) 加入染色液1?40min，其中染色液为含重量体积比0. 0001?0. 001 %的4H-[1]-苯 并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物及按体积比0. 5?5%的乙酸水溶液； 4) 加入洗脱液，洗脱液为体积比0. 5?5%的乙酸，10?70%乙醇及0. 5?2%乙醇胺 水溶液，洗脱1?3次，每次1?lOmin ; 5) 检测。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中凝胶固定时间为30min，固定液为 按体积比40 %乙醇/10 %乙酸溶液。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中凝胶在高碘酸溶液里氧化时间为 20min，其中高碘酸溶液为含重量体积比0. 5%的高碘酸及按体积比1 %的乙酸水溶液。然 后用按体积比1 %的乙酸水溶液冲洗3次，每次5min。
6. 如权利要求3?5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)染色液组成为按重量体 积比为0. 0002% 4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物及按体积比1% 的乙酸水溶液。
7. 如权利要求3?5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)洗脱液组成为按体积比 1 %乙酸，40%乙醇及1 %乙醇胺水溶液。
8. 如权利要求3?5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)染色时间为15min。
9. 如权利要求3?5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)洗脱时间为20min。
10. 如权利要求3?5任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)可在激光扫描仪下观察 染色后的糖蛋白。
【文档编号】G01N21/64GK104251849SQ201310268939
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月25日 优先权日:2013年6月25日
【发明者】金利泰, 丛维涛, 朱忠欣, 洪国赢 申请人:温州安得森生物科技有限公司