由高压冷冻材料制作电子显微镜样品的制作方法
【专利摘要】本发明涉及由带有高压冷冻样品材料的毛细管制作样品的方法，该方法包括：提供具有玻璃化的样品材料的高压毛细管的步骤(102)，该样品材料处于低于玻璃化转变温度Tg的温度T1，和切割该毛细管的步骤(104)，其特征在于将该毛细管升温到介于温度T1和温度Tg之间的温度T2的步骤(106)，将该毛细管冷却到低于温度T2的温度T3的后续步骤(108)，其结果是材料从该毛细管中挤出，和在低于温度Tg的温度下从挤出的样品材料释放样品的步骤(112)。发明人意外地发现玻璃化的生物材料可以在温度T＝88K的液体内(液氮，通过升温到例如130K然后冷却毛细管到88K)从毛细管中挤出。这样不仅导致材料挤出，而且更令人意外的是重复的温度循环常常引起样品材料的进一步挤出。可以从由此挤出的样品材料上切下样品，例如通过离子束切削。
【专利说明】由高压冷冻材料制作电子显微镜样品
【技术领域】
[0001]本发明涉及由带有高压冷冻样品材料的毛细管制作样品的方法，该方法包括: ?提供具有玻璃化的(Vitrified)样品材料的高压毛细管的步骤，该样品材料处于低
于玻璃化转变温度Tg的温度T1，和?切割该毛细管的步骤。
【背景技术】
[0002]从Leica 微系统(Leica Microsystems)的 “Leica EM PACT applicationtoochure (应用手册)”上可以得知这样一种方法，该手册从互联网上可得到，又称为Leica手册[_1_]。
[0003]当在TEM(透射电子显微镜)下观察样品时，样品被能量通常在60keV到300keV范围的电子束照射，尽管已知可以使用更低或更高的能量。通过观察透射过样品的电子得到图像。因此样品必须是薄的样品，典型厚度小于I μ m,更特别地小于200nm，最特别地小于lOOnm。当观察生物样品时样品典型地切成薄切片。为了此目的样品首先要固化。这通过例如用塑胶(plastic)替代所有的水来实现，即所谓的树脂包埋，但是采用低温成像取得了更好的结果。
[0004]低温成像包括将样品材料冷冻到不形成冰晶体(因为这些会破坏样品)的冷冻温度(cryogenic temperature),在该冷冻温度下将样品切片，并在该冷冻温度下观察样品。
[0005]能够在冷冻温度下观察样品的透射电子显微镜是市售的。
[0006]同样冷冻样品的设备也是市售的。这些设备的一部分采用高压冷冻原理，其中样品，容纳在容器(holder)中，首先加压到大约2100巴的压力，然后快速冷却到大约165K的温度Tg，水的玻璃化转变温度。随后将该容器减压，然后可以释放该容器内的样品材料。
[0007]在一组这类设备中使用毛细管，例如铜毛细管。采用这些毛细管的这类样品制备设备和方法的实例描述在Leica手册[-1-]中，具体见第7和8页。样品材料被吸入外径为650 μ m和内径为300 μ m的铜毛细管中。然后将该毛细管装入容器中，暴露于2100巴的压力下并随后迅速冷冻(典型地> 600K/S)到165K温度或更低。
[0008]现有技术方法是通过将带有毛细管和样品材料的容器浸入液氮(LN2)中，将毛细管从容器移除，并将毛细管转移到低温超薄切片机进行的。在低温超薄切片机中，毛细管材料被移除并且样品材料被切片制成样品。
[0009]应指出还已知在冷冻温度下将样品切片，接着是冷冻-置换步骤，然后是在室温下的突光标记步骤，接着是在室温下观测(inspection)。见M.Karreman等,“VIS2FIX:AHigh-Speed Fixation Method for Immuno-Electron Microscopy，，，Traffic,第 12 卷，2011 年 7 月发行，第 806-814 页，另称为 Karreman [-2-] ?
[0010]已知对样品的机械切割引入了制品(artifact),见例如“An oscillatingcryo-knife reduces cutting-1nduced deformation of vitreous ultrathinsections”，A.Al-Amoudi 等，J.Microsc.2003 (十月)，212 (Ptl)，26-33 页，另称为Al-Amoudi [-3-]。这些制品是由样品材料上的机械力产生的。因此，近来使用聚焦离子束(FIB)加工对样品材料进行切片，其中材料被聚焦离子束切削(mill)(溅射分开)，例如能量在10到40keV之间的鎵离子束。FIB切片实现了无力(forceless)切割。
[0011]对毛细管进行FIB切片的一个缺点是毛细管的铜或钢的切削速度比生物材料更低。而且，壁厚度与样品材料芯的直径相比是相当大的。这表明大量的毛细管材料必须以低切削速度移除以形成样品材料切片(样品，也称为薄片)。低的切削速度和相对大的材料量造成了长的产出时间(throughput time)。
[0012]需要由毛细管制作样品而不在样品材料上施加力且具有比现有技术方法更快的产出时间。
【发明内容】
[0013]本发明旨在提供上述问题的解决方案。
[0014]为了该目的，本发明方法的特征在于将毛细管升温到介于T1和Tg之间的温度T2的步骤，冷却毛细管到低于T2的温度T3的后续步骤，其结果是材料从毛细管中挤出(extrude),和在低于Tg的温度下从挤出的样品材料释放(freeing)样品的步骤。
[0015]发明人意外地发现提高毛细管的温度然后将它再次冷却会造成样品材料从毛细管开口端挤出。发明人不能对此提供物理解释。这不仅仅是热膨胀的结果，因为在与最初切割毛细管时相同的温度下观察到这种挤出。
[0016]应指出由于温度降低造成冰挤出已记载在EP专利申请公开EP2009421A1号中，特别是[0047]段。然而，该申请提及了在冷冻过程中由于温度降低造成的挤出，但未公开或暗示这是由于冷冻后的温度升高和后续的降低造成的。
[0017]在本发明的一个实施方式中将毛细管冷却到低于温度T2的温度T3的后续步骤包括将毛细管浸入温度低于温度T2的液体中，特别是浸入液体乙烷，液体丙烷或液氮中。
[0018]通过将毛细管插入，例如液体乙烷，液体丙烷或液氮中可以轻易地将其冷却。
[0019]应指出在之前提到的专利申请公开EP2009421A1中暗示当样品引入透射电子显微镜(TEM)中时温度升高，但是将样品引入TEM中意味着不能进行后续的液体浸泡，因为TEM的内部是高度真空的。
[0020]在一个优选的实施方式中所述毛细管是金属毛细管。
[0021]虽然纤维素毛细管是已知的，但是挤出仅在金属毛细管中观察到。这类毛细管优选由包含铁或铜，铁和/或铝的金属制成。
[0022]在另一优选实施方式中温度T2和T3之间的差值超过20K，优选超过50K。
[0023]所述效应被认为是由热膨胀/收缩引起的。假定毛细管和芯材具有恒定的线性热膨胀系数，则挤出的芯材的长度与温度差成正比。因此更高的温度差会造成更大的挤出。
[0024]在一个实施方式中释放样品的步骤包括用聚焦离子束切割。
[0025]切割材料片，例如具有生物材料的冰，本身是本领域技术人员已知的方法。
[0026]在进一步的实施方式中所释放的样品是薄片。
[0027]薄片，其为大致矩形的样品材料切片，厚度在30到300nm，是透射电子显微镜分析中的优选样品。
[0028]在更进一步的实施方式中该方法进一步包括在电子显微镜中观测的步骤。 样品制作产生了待在TEM或STEM中观测的样品。观测可以在冷冻温度下进行，或者在例如在室温下对样品进行冷冻置换和荧光标记之后在室温下进行。这类方法记载于Karreman-2-]中。
[0029]在优选的实施方式中，将毛细管升温到处于温度T1和温度Tg之间的温度T2的步骤和冷却毛细管到低于温度T2的温度T3的后续步骤，其结果是材料从毛细管中挤出，之后接着是将毛细管升温到处于温度T1和温度Tg之间的温度T2的进一步的步骤和冷却毛细管到低于温度T2的温度T3的进一步的后续步骤，其结果是更多材料从毛细管中挤出。
[0030]发明人意外地发现在很多情况下升温/冷却循环的重复造成样品材料的进一步挤出，虽然该过程不能无限期地重复。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]本发明现在采用附图来说明，其中相同的附图标记指示相应的特征。
[0032]为了此目的:
附图1示意性地显示了本发明方法的流程图，
附图2显示了带有挤出的样品材料的毛细管的照片。
【具体实施方式】
[0033]附图1示意性地显示了本发明方法的流程图。
[0034]在步骤102中，将带有高压冷冻样品材料的毛细管提供于LN2中。这类毛细管，例如铜毛细管，可以采用高压冷冻器制备，如产自德国韦茨拉尔的Leica MicrosystemsGmbh.的 EM PACT2?。
[0035]在步骤104中，将浸入LN2的毛细管，引入低温超薄切片机以切割毛细管，例如产自Leica Microsystems Gmbh.，韦茨拉尔，德国的EM-UC7/FC7?。该切割常规地在毛细管浸入LN2中时进行。
[0036]在步骤106中，将经切割的毛细管“加热”到大约130K的温度，在(沸腾)LN2的温度(77K)以上大约50K。
[0037]在步骤108中，通过将其浸入LN2中将经切割的毛细管再次冷却到LN2的温度。
[0038]在步骤110中，将切去顶端的毛细管在温度130K下引入FIB或双波束(Dual-Beam)设备中。合适的双波束设备，包括用于切削的聚焦离子束柱和用于成像的扫描电子显微镜柱，例如产自美国希尔斯伯勒FEI Company的Quanta3D?。发明人观察到在大多数情况下(大约90%的情况)样品材料从毛细管中挤出。
[0039]在步骤112中，由样品材料芯制成样品并装载到样品托架(sample carrier)上。
[0040]突出的芯现在可以在冷冻温度下用离子束切片。该方法本身是本领域技术人员已知的。如必要的话不仅可以用离子束将样品切片，还可以将它变薄。然后将完成的样品放置在样品托架上。这类样品托架优选为TEM格栅(grid)(典型地3mm左右(round))或另一专门用于TEM的样品托架，例如在美国专利7，767，979号中描述的样品托架。
[0041]在步骤114中，将装载在样品托架上的样品引入电子显微镜并观测/观察，例如透射电子显微镜(TEM)或扫描透射电子显微镜(STEM)。
[0042]应指出该观测可以在冷冻温度下在冷冻-TEM中观测，例如产自美国希尔斯伯勒的FEI Company的Titan Krios?,或者在室温TEM中观测，例如美国希尔斯伯勒的FEICompany的Titan80-300?。可选择地，代替步骤114，可以实施步骤116的冷冻置换和加热样品到室温，接着是步骤118的室温下荧光标记。以这种方式可以使用相关的光学/电子显微镜，借助荧光标记引导进行观察并用小于Inm的电子光学分辨率成像。该方法在Karreman[-2-]中记载为VIS2FIXfs方法。另一在室温下得到样品的方法，VIS2FIXH方法也记载于 Karreman [_2_]中。
[0043]使用该方法，在室温下得到样品，成像可以在室温下以及在步骤120中进行。
[0044]本领域技术人员清楚这一步骤顺序是许多种顺序中的一种:任选地可以重复步骤106/108的升温/冷却循环。通过使用例如丙烷代替液氮等，温度可以在不同的界限内选择。也可以引入用于电子显微镜分析的染色/标记步骤(例如用电子致密材料如铀酰、四氧化锇、量子点、重金属簇等)。
此外，还应明确指出所提到的温度不应解释为绝对界限:重要的是样品材料不会由其非结晶态或玻璃态转变到结晶态(通过保持温度低于玻璃化转变温度Tg)，并且在步骤104、106和108(?\和T2)之间大的温度差比小的温度差能引起更大的挤出。
[0045]附图2显示了用SEM拍摄的照片，显示了带有样品材料的毛细管。毛细管202是铜毛细管，其外径为大约650 μ m且内径为300 μ m。挤出的芯204是玻璃状的冰，其内有生物材料，所述生物材料包括例如细胞、细菌、病毒等，其延伸超过224 μ m的长度226。
[0046]在电子显微镜分析中提及“生物材料”时通常指主要包含碳氢化合物的材料，因而包括聚合物、塑料等。其原因是所有这些材料在电子显微镜中显示弱的对比(weakcontrast),因为多数核为轻核,所述核显示出可比的(comparable)与照射所述样品的电子的相互作用。因此在本文中所有的主要包含碳氢化合物的材料均涵盖在表述“生物材料”中。
[0047]非专利文献
[-1-] “Leica EM PACT application brochure，，，http: //www.leica-microsystems.c0.kr/pdfs.nsf/(ALLIDs)/D5AA3952E2A44A56C1256F100022B5CC/SFILE/EM PACTApplication Brochure 09 04.pdf
[-2-]VIS2FIX:A High-Speed Fixation Method for Immuno-Electron Microscopy”，M.Karreman et al., Traffic, Vol 12，issue July2011, pages806-814.[-3-] “An oscillating cryo-knife reduces cutting-1nduced deformationof vitreous ultrathin sections”，A.Al-Amoudi et al., Journal ofMicroscopy,Vol.212Issuel，Pages26_33.
【权利要求】
1.由带有高压冷冻样品材料的毛细管制作样品的方法，该方法包括: ?提供具有玻璃化的样品材料的高压毛细管的步骤(102)，该样品材料处于低于玻璃化转变温度Tg的温度T1，和 ?切割该毛细管的步骤(104)， 其特征在于 ?将该毛细管升温到介于温度T1和温度Tg之间的温度T2的步骤(106)， ?将该毛细管冷却到低于温度T2的温度T3的后续步骤(108)，其结果是材料从该毛细管中挤出，和 ?在低于温度Tg的温度下从挤出的样品材料释放样品的步骤(112)。
2. 权利要求2的方法，其中将所述毛细管冷却到低于温度T2的温度T3的后续步骤(108)包括将所述毛细管浸入温度低于温度T2的液体中，特别是浸入液体乙烷，液体丙烷或液氣中。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述毛细管是金属毛细管。
4.权利要求3的方法，其中所述金属包含铜和/或铁和/或铝。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中温度T2和T3之间的差值大于20K,优选大于50K。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述释放样品的步骤包括用聚焦离子束切割。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所释放的样品是薄片。
8.权利要求7的方法，其中该方法进一步包括在电子显微镜中观测的步骤。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述毛细管升温到介于温度T1和温度Tg之间的温度T2的步骤(106)和将所述毛细管冷却到低于温度T2的温度T3的后续步骤(108)，其结果是材料从所述毛细管中挤出，之后接着是将所述毛细管升温到介于温度T1和温度Tg之间的温度T2的进一步的步骤和将所述毛细管冷却到低于温度T2的温度T3的进一步的后续步骤(108)，其结果是更多材料从所述毛细管中挤出。
【文档编号】G01N1/28GK103543045SQ201310301331
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2012年7月13日
【发明者】R·J·P·G·沙姆佩斯, M·F·哈勒斯, D·A·M·德温特, C·T·W·M·施内登伯格 申请人:Fei公司