生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法,包括：生物组织样品前处理步骤：在0～4℃下，按质量比1：（3～5）混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的生物组织样品和生理盐水制得生物组织匀浆样品，然后按体积比为1：4混合所述生物组织匀浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及通过液相色谱-质谱联用分离经前处理的生物组织样品中的2,3-吲哚醌、并测定生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的检测步骤。
【专利说明】生物组织样品中2, 3-吲哚醌的浓度的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药检测领域，涉及一种内源性活性化合物2,3_吲哚醌的生物 体内组织器官样品（生物组织样品）中的浓度的测定方法。
【背景技术】
[0002]2, 3-卩引哚醌（2, 3-Indolinedione，Isatin，ISA)，又名靛红，是近年发现存在于人 和动物体内的一种内源性活性因子，具有多种生物活性。
[0003]液相色谱与质谱联用技术（LC-MS)，尤其是其中的液相色谱-大气压电离质谱联 用技术（LC-API-MS)，是目前分析生物样品中痕量物质的首选。它兼具了液相色谱与质谱两 种技术的优点，具有高灵敏度和专一性，，并大大缩短分析时间。
[0004] 目前，已有报道的2, 3-吲哚醌测定方法有ECL、GC-MS、LC-MS以及HPLC等方法，这 些方法大多样品前处理复杂，有些需要对生物样品进行多步纯化处理，实验操作过程比较 繁琐，而且样品分析时间较长，被用于2, 3-吲哚醌的体内药代动力学研究中大批生物样品 的分析测试方法还很少，且存在以上问题，因此在处理药代动力学研究中所产生的大量样 品就需要开发高通量的快速分析方法，特别是样品前处理简便、检测手段灵敏的快速分析 方法。例如中国专利CN102735764A公开一种血浆中利巴韦林含量的测定方法，该方法使用 较为简便的血浆预处理方法，并使用LC-MS法检测，灵敏度较高。但是目前关于生物组织样 品中2, 3-吲哚醌浓度的快速简便灵敏的测定方法还鲜有报道。
【发明内容】
[0005] 基于2, 3-吲哚醌的临床前药代动力学研究中存在的生物样品浓度分析方法中的 问题，本发明的目的在于提供一种高通量快速检测生物组织样品中2, 3-吲哚醌浓度的一 种液质联用分析方法。
[0006] 在此，本发明提供一种生物组织样品中2, 3-吲哚醌的浓度的测定方法，包括： 生物组织样品前处理步骤：在〇?4°C下，按质量比1 : (3?5)混合动物给予2, 3-吲 哚醌后采集的生物组织样品和生理盐水制得生物组织匀浆样品，然后按体积比为1 :4混合 所述生物组织匀浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30?90秒后离心取上清液；以及 通过液相色谱-质谱联用分离经前处理的生物组织样品中的2, 3-吲哚醌、并测定生物 组织样品中2, 3-吲哚醌的浓度的检测步骤； 其中，液相色谱条件包括：色谱柱为XBridgeC18, 5iim，2.IX50mm;色谱流动相A为浓 度为〇. 1%甲酸水溶液，流动相B为浓度为0. 1%甲酸甲醇，以流动相A先减少后增加且流 动相B先增加后减少的双梯度进行洗脱； 质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气 压力为40psi;气体流速为8L/min;毛细管电压为5500V;离子源温度为550°C，内标法定 量。
[0007] 本发明通过甲醇蛋白沉淀法处理生物组织样品，用液相色谱质谱联用仪器分析生 物组织样品中2, 3-吲哚醌的浓度。因此，本发明的方法具有前处理简便、检测手段灵敏专 一、检测速度快的优点。本发明的方法的准确度、精密度及检测限符合生物样品分析方法学 验证要求，能够满足2, 3-吲哚醌的药代动力学研究中生物组织样品的浓度测定需要。
[0008] 本发明中，生物组织样品可为脾脏、心脏、胃、肾脏、肺、肌肉、睾丸、胰腺和/或脂 肪,此时生物组织样品和生理盐水的质量比可为1 :3。
[0009] 本发明中，生物组织样品还可为肝、脑样、卵巢、子宫、前列腺、大肠、小肠、皮肤 和/或膀胱，此时生物组织样品和生理盐水的质量比可为1 :5。
[0010] 在所述生物组织样品前处理步骤中，所述内标物甲醇溶液优选为50ng/mL的奎 硫平甲醇溶液。
[0011] 在所述检测步骤中，所述液相色谱条件还包括：柱温为为40°c、自动进样器温度 为4°C、流速为500iiL/min、进样量为liiL。
[0012] 又，在所述检测步骤中，液相色谱的洗脱梯度可为：
【权利要求】
1. 一种生物组织样品中2,3_吲哚醌的浓度的测定方法，其特征在于，所述测定方法包 括：生物组织样品前处理步骤：在O?4°C下，按质量比1 : (3?5)混合动物给予2, 3-吲 哚醌后采集的生物组织样品和生理盐水制得生物组织匀浆样品，然后按体积比为1 : 4混 合所述生物组织匀浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30?90秒后离心取上清液；以及通过 液相色谱-质谱联用分离经前处理的生物组织样品中的2, 3-吲哚醌、并测定生物组织样品 中2, 3-吲哚醌的浓度的检测步骤；其中，液相色谱条件包括：色谱柱为XBridge C18, 5 ii m， 2. I X 50mm;色谱流动相A为浓度为0. I %甲酸水溶液，流动相B为浓度为0. I %甲酸甲醇， 以流动相A先减少后增加且流动相B先增加后减少的双梯度进行洗脱； 质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气 压力为40psi ;气体流速为8L/min ;毛细管电压为5500V ;离子源温度为550°C，内标法定 量。
2. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述生物组织样品为脾脏、心脏、胃、 肾脏、肺、肌肉、睾丸、胰腺和/或脂肪，所述质量比为1 : 3。
3. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述生物组织样品为肝、脑样、卵巢、 子宫、前列腺、大肠、小肠、皮肤和/或膀胱，所述质量比为1 : 5。
4. 根据权利要求1?3中任一项所述的测定方法，其特征在于，在所述生物组织样品前 处理步骤中，所述内标物甲醇溶液为50ng/mL的奎硫平甲醇溶液。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的测定方法，其特征在于，液相色谱条件还包括： 柱温为40°C、自动进样器温度为4°C、流速为500ii L/min、进样量为I ii L。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的测定方法，其特征在于，液相色谱的洗脱梯度 为：
〇
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述质谱条件还包括： 用于定量分析的离子对为：2, 3-吲哚醌：148 - 65. 1 ;奎硫平：384. 1 - 253. 1。
8. 根据权利要求1?7中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的最低检 测限为10ng/mL。
9. 根据权利要求1?8中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的相对误 差和相对标准偏差均在15 %以内。
【文档编号】G01N30/06GK104345097SQ201310333153
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】陈春麟, 吕文旭, 陈昊, 史卉妍, 汪俊 申请人:上海美迪西生物医药有限公司