一种过氧化氢残留的快速测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种过氧化氢残留的快速测定方法，利用检测试纸快速测定待测样品中残留的过氧化氢，为一种稳定性好、操作简便、经济实用的能现场快速检测样品中残留过氧乙酸含量的方法，该方法响应时间快，灵敏度高，最低可检测过氧化氢的含量为0.5mg/L。本发明方法可广泛适用于食品、日化及医疗行业中，对各种经消毒或漂白的样品中过氧化氢残留含量进行快速、有效的监测。
【专利说明】一种过氧化氢残留的快速测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种过氧化氢残留的快速测定方法。
【背景技术】
[0002]过氧化氢是一种强氧化剂，具有消毒、杀菌、漂白等功能，在工业及医疗领域广泛使用。在食品工业中，过氧化氢主要用于软包装纸的消毒、罐头厂的消毒剂、奶和奶制品杀菌等。食品中过氧化氢残留浓度过高对人类具有致癌的危险性，还可能加速人体衰老。所以，《食品添加剂使用卫生标准》GB2760-2002中规定:过氧化氢作为食品添加剂只能用于鲜牛乳和袋装豆腐干，同时规定在袋装豆腐干中不得有残留，其它食品中使用过氧化氢必须经过卫生部的严格审批。但是不法商人对过氧化氢在食品加工尤其是保存中的滥用严重威胁到人们的身体健康，因此，建立一种简单快速的食品中残留过氧化氢浓度测定的方法显得尤为重要。
[0003]目前用于食品和保健食品中残留过氧化氢的检测方法有很多:如氧化还原滴定法、改良4-氨基安替比啉(4-AA)比色法和氧电极法等，这些方法有的操作十分繁琐，有的需用到大型的分光光度计，均不利于食品加工企业、食品监督部门乃至广大的消费者对食品中过氧化氢残留浓度进行现场快速监测。
[0004]试纸法因无二次污染、使用方便、易于携带等优点而成为目前最受消费者青睐的一种现场检测方法。ELISA试剂盒中采用显色底物和过氧化氢来检测过氧化物酶，同样可利用该原理通过显色剂和过氧化物酶来检测过氧化氢。该方法中可采用的显色剂种类有很多，如专利ZL 200610011568.9中提到的苯酚与4-氨基安替吡啉、N, N- 二甲基苯胺、2，4- 二氯酚以及邻二苯酚分别组合显色，除此之外，还有四甲基联苯胺(TMB)、TMB盐、2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)等，不同的显色剂显色灵敏度和试剂本身的稳定性有较大的差异。该方法中过氧化物酶在干燥和储存过程中极易变性而失活。研究表明蛋白酶冻干过程中常用到的冻干保护剂对过氧化物酶干燥和储存过程同样可起到保护作用；选择出灵敏度高、稳定性好的显色剂，并选择合适的PH调节剂和酶保护剂制作出灵敏度高、稳定性好的试纸是本发明的主要目的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种过氧化氢残留的快速测定方法。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
一种过氧化氢残留的快速测定方法，包括以下步骤:将过氧化氢残留快速测定试纸浸入待测样品制成的试液中，2秒后取出，甩去试纸上多余的溶液，显色完全后，将试纸所显的颜色与标准比色卡相比较，读出过氧化氢残留的浓度数据；
其中，过氧化氢残留快速测定试纸由以下方法制备:用纯水将辣根过氧化物酶、显色齐U、PH调节剂、蛋白酶保护剂配制成混合液，将滤纸在混合液中浸泡5?30min后取出，烘干成形，裁切至设定尺寸，粘贴在底板上，制得用于测定过氧化氢残留的试纸；所述混合液中，辣根过氧化物酶的浓度为0.0l?0.10g/L，显色剂的浓度为1.0?2.5 g/L。
[0007]优选的，所述显色剂为四甲基联苯胺盐酸盐、四甲基联苯胺硫酸盐、四甲基联苯胺丙磺酸盐或2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
[0008]优选的，所述蛋白酶保护剂为糖、氨基酸、蛋白质和聚合物的混合物。
[0009]优选的，所述蛋白酶保护剂中，糖为蔗糖、海藻糖中的至少一种；氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一种；蛋白质为牛血清蛋白、人血清白蛋白中的至少一种；聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
[0010]优选的，所述蛋白酶保护剂中，糖为海藻糖，氨基酸为甘氨酸，蛋白质为人血清白蛋白，聚合物为聚乙二醇。
[0011]优选的，所述混合液中，糖的浓度为4?20g/L，氨基酸的浓度为2?10g/L，蛋白质的浓度为I?5g/L，聚合物的浓度为4?20g/L。
[0012]优选的，所述pH调节剂为柠檬酸与磷酸氢二钠的混合物，混合液中，柠檬酸的浓度为0.028?0.044mol/L，磷酸氢二钠的浓度为0.11?0.14 mol/L。
[0013]所述标准比色卡，由以下方法制备:
1)用纯水配制浓度为0.5mg/L的过氧化氢标准溶液,将过氧化氢残留快速测定试纸浸入标准溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待试纸所呈现的颜色稳定后，在潘通色卡上找出对应的标准色；
2)同步骤I)所述方法，分别获得检测浓度为lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的过氧化氢标准溶液时试纸所呈现的标准色；
3)根据各标准色的色值制备得到标准比色卡。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明提供了一种灵敏度高、稳定性好、操作简便、经济实用的能现场快速检测样品中残留过氧化氢含量的方法，该方法响应时间快，不超过15秒，试纸检测灵敏度高，最低可检测过氧化氢的含量为0.5mg/Lo
[0015]本发明方法所用试纸中的pH调节剂即可保持辣根过氧化物酶的活性也可缓冲试样的PH，保证了测试结果的准确性；试纸中的酶保护剂保证了酶试纸的稳定性，在室温的条件下，避光密闭保存，保质期至少可达到12个月；试纸的面积小，单次测试试剂用量只有普通实验室方法的几百分之一，且测试过程简单，无需其它仪器和配件，可大大节约测试成本；试纸的可持式底板可防止拿取的过程中受人手的污染，十分安全可靠。
[0016]本发明方法可广泛适用于食品、日化及医疗行业中，对各种经消毒或漂白的样品中过氧化氢残留含量进行快速、有效的监测。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为标准比色卡1#的视图。
【具体实施方式】
[0018]一种过氧化氢残留的快速测定方法，包括以下步骤:将过氧化氢残留快速测定试纸浸入待测样品制成的试液中，2秒后取出，甩去试纸上多余的溶液，显色完全后，将试纸所显的颜色与标准比色卡相比较，读出过氧化氢残留的浓度数据；
其中，过氧化氢残留快速测定试纸由以下方法制备:用纯水将辣根过氧化物酶、显色齐U、PH调节剂、蛋白酶保护剂配制成混合液，将滤纸在混合液中浸泡5?30min后取出，烘干成形，裁切至设定尺寸，粘贴在底板上，制得用于测定过氧化氢残留的试纸；所述混合液中，辣根过氧化物酶的浓度为0.0l?0.10g/L，优选浓度为0.04?0.06g/L，最佳浓度为
0.05g/L。
[0019]所述显色剂为易溶于水的四甲基联苯胺(TMB)盐酸盐、TMB硫酸盐、TMB丙磺酸盐以及2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)中的一种，其中TMB盐酸盐显蓝色，TMB硫酸盐、TMB丙磺酸盐以及ABTS均显蓝绿色。所述混合液中，显色剂的浓度为1.0?2.5 g/L ;优选的显色剂为TMB盐酸盐，其在混合液中最佳浓度为2g/L。
[0020]所述的蛋白酶保护剂为糖、氨基酸、蛋白质和聚合物的混合物，其中，糖为蔗糖、海藻糖中的至少一种，优选为海藻糖；氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一种，优选为甘氨酸；蛋白质为牛血清蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)中的至少一种，优选为HSA ;聚合物为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的至少一种，优选为PEG。所述混合液中，蛋白酶保护剂中糖、氨基酸、蛋白质和聚合物的浓度分别为4?20g/L、2?10g/L、l?5g/L、4?20g/L ;优选浓度分别为:5?15g/L、4?6g/L、2?4g/L、5?15g/L ;最佳浓度分别为:10g/L、5 g/L、3g/L、10 g/L。
[0021]优选的，所述pH调节剂为柠檬酸与磷酸氢二钠的混合物，混合液中，柠檬酸的浓度为0.028?0.044mol/L，磷酸氢二钠的浓度为0.11?0.14 mol/L。
[0022]所述滤纸为层析滤纸、定性滤纸和定量滤纸中的一种；优选为层析滤纸。
[0023]优选的，将滤纸置于低于30°C条件下真空干燥，烘干成形，将此滤纸裁切成25?IOOmm2的小块，用胶粘在长条状的底板一端，即制得用于测定过氧化氢残留的试纸；所述底板的宽度为5?IOmm,长度为50mm?120mm ;所述底板由不吸水的塑料板制成。
[0024]所述标准比色卡，由以下方法制备:
1)用纯水配制浓度为0.5mg/L的过氧化氢标准溶液,将过氧化氢残留快速测定试纸浸入标准溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待试纸所呈现的颜色稳定后，在潘通色卡上找出对应的标准色；
2)同步骤I)所述方法，分别获得检测浓度为lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的过氧化氢标准溶液时试纸所呈现的标准色；
3)根据各标准色的色值制备得到标准比色卡。
[0025]本发明方法检测过氧化氢残留的响应时间快，灵敏度高，最低可检测过氧化氢的含量为0.5mg/L ;试纸中的pH调节剂即可保持辣根过氧化物酶的活性也可缓冲试样的pH值，保证了测试结果的准确性；试纸中的酶保护剂保证了试纸的稳定性，在室温条件下，避光密闭保存，保质期至少可达到12个月；试纸的面积小，单次测试试剂用量只有普通实验室方法的几百分之一，且测试过程简单，无需其它仪器和配件，可大大节约测试成本；试纸的可持式底板可防止拿取试纸的过程中受人手的污染，十分安全可靠。
[0026]下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0027]实施例1
用纯水配制含0.05g/L辣根过氧化物酶、2.0g/L TMB盐酸盐、0.037mol/L柠檬酸、0.126mol/L 磷酸氢二钠、10 g/L 海藻糖、5 g/L 甘氨酸、3g/LBSA、10 g/LPEG4000 的混合显色液。将层析滤纸完全浸泡至上述混合液中约10分钟，取出滤纸，在低于30°C温度下真空干燥，将此滤纸切成5X6 mm的小块,用胶粘在5X80_条状的底板一端，即制成过氧化氢残留测定试纸1#。
[0028]实施例2
用纯水配制含0.0I g/L辣根过氧化物酶、1.0g/L TMB硫酸盐、0.028mol/L柠檬酸、
0.llmol/L磷酸氢二钠、10g/L海藻糖、5g/L精氨酸、2g/LBSA、lg/LHSA、10 g/LPVP K30 的混合显色液。将层析滤纸完全浸泡至上述混合液中5分钟，取出滤纸，在低于30°C温度下真空干燥，将此滤纸切成5X5 mm的小块,用胶粘在5X50mm条状的底板一端，即制成过氧化氢残留测定试纸2#。
[0029]实施例3
用纯水配制含0.025g/L辣根过氧化物酶、1.5g/L TMB丙磺酸盐、0.044mol/L柠檬酸、
0.14mol/L磷酸氢二钠、2g/L鹿糖、2g/L海藻糖、2g/L甘氨酸、lg/LHSA、4g/LPEG6000的混合显色液。将定性完全浸泡至上述混合液中约20分钟，取出滤纸，在低于30°C温度下真空干燥，将此滤纸切成5X5 mm的小块,用胶粘在5X50mm条状的塑料硬板一端，即制成过氧化氢残留测定试纸3#。
[0030]实施例4
用纯水配制含0.1 g/L辣根过氧化物酶、2.5g/L ABTS、0.044mol/L柠檬酸、0.14mol/L磷酸氢二钠、20g/L蔗糖、6g/L谷氨酸、2g/L甘氨酸、2g/L精氨酸、4g/LHSA、20g/LPEG8000的混合显色液。将定量滤纸完全浸泡至上述混合液中30分钟，取出滤纸，在低于30°C温度下真空干燥，将此滤纸切成IOX IOmm的小块,用胶粘在IOX 120mm条状的塑料硬板一端，即制成过氧化氢残留测定试纸4#。
[0031]实施例5
制备与试纸1#配套使用的标准比色卡1#:
1)用纯水配制浓度为0.5mg/L的过氧化氢标准溶液,将实施例1制备的试纸浸入溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，15秒后根据试纸所呈现的颜色在潘通色卡上找出色调一致的标准色；
2)同步骤I)所述方法，分别获得检测浓度为lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的过氧化氢标准溶液时试纸所呈现的标准色；
3)根据得到的各潘通标准色所列色值采用电脑调色和印制，得到标准比色卡1#(如图1所示)。
[0032]实施例6
同实施例5所述的方法，分别制备得到与检测试纸2#?4#配套使用的标准比色卡
2# ?4# ο
[0033]实施例7
将过氧化氢残留测定试纸1#、2#、3#、4#置于密实袋中，放置37°C烘箱中，每隔30天观察试纸外观及进行显色效果测试。测试方法:配制lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L系列过氧化氢标准溶液,分别将试纸I#、2#、3#、4#插入标准溶液中2秒后取出，甩去试纸上多余的溶液，显色完全后观察显色效果，并分别与标准比色卡1#、2#、3#、4#对照，读出过氧化氢浓度的数据。随着过氧化氢含量的增加，试纸所显的颜色逐渐加深。检测结果
如表I-4所示:
表I实施例1中过氧化氢残留试纸的稳定性_
【权利要求】
1.一种过氧化氢残留的快速测定方法，包括以下步骤:将过氧化氢残留快速测定试纸浸入待测样品制成的试液中，2秒后取出，甩去试纸上多余的溶液，显色完全后，将试纸所显的颜色与标准比色卡相比较，读出过氧化氢残留的浓度数据； 其中，过氧化氢残留快速测定试纸由以下方法制备:用纯水将辣根过氧化物酶、显色齐U、PH调节剂、蛋白酶保护剂配制成混合液，将滤纸在混合液中浸泡5?30min后取出，烘干成形，裁切至设定尺寸，粘贴在底板上，制得用于测定过氧化氢残留的试纸；所述混合液中，辣根过氧化物酶的浓度为0.0l?0.10g/L，显色剂的浓度为1.0?2.5 g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述显色剂为四甲基联苯胺盐酸盐、四甲基联苯胺硫酸盐、四甲基联苯胺丙磺酸盐或2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述蛋白酶保护剂为糖、氨基酸、蛋白质和聚合物的混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述蛋白酶保护剂中，糖为蔗糖、海藻糖中的至少一种；氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一种；蛋白质为牛血清蛋白、人血清白蛋白中的至少一种；聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述蛋白酶保护剂中，糖为海藻糖，氨基酸为甘氨酸，蛋白质为人血清白蛋白，聚合物为聚乙二醇。
6.根据权利要求3、4或5所述的方法，其特征在于:所述混合液中，糖的浓度为4?20g/L，氨基酸的浓度为2?10g/L，蛋白质的浓度为I?5g/L，聚合物的浓度为4?20g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述pH调节剂为柠檬酸与磷酸氢二钠的混合物，混合液中，柠檬酸的浓度为0.028?0.044mol/L，磷酸氢二钠的浓度为0.11?0.14mol/L0
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述标准比色卡，由以下方法制备: 1)用纯水配制浓度为0.5mg/L的过氧化氢标准溶液,将过氧化氢残留快速测定试纸浸入标准溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待试纸所呈现的颜色稳定后，在潘通色卡上找出对应的标准色； 2)同步骤I)所述方法，分别获得检测浓度为lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的过氧化氢标准溶液时试纸所呈现的标准色； 3)根据各标准色的色值制备得到标准比色卡。
【文档编号】G01N21/78GK103439323SQ201310337923
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】阙绍辉, 秦惠, 邓金花, 黄报亮 申请人:广东环凯微生物科技有限公司