MUC15与p-AKT在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及MUC15与p-AKT在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。首次揭示肝细胞癌中粘蛋白MUC15在癌中较癌旁明显低表达，且这种低表达与肝癌的恶性临床病理指标存在明显的相关性。并且，本发明揭示了肿瘤样本中MUC15和p-AKT水平的负相关性，建立了一种肝细胞癌的预后评估的方法。
【专利说明】MUC15与p-AKT在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物检测【技术领域】，更具体地，本发明涉及MUC15蛋白与P-AKT蛋 白的负相关性，及其在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌是最致命的恶性肿瘤之一，世界范围内，占肿瘤相关死亡的第三位，更是 肝硬化病人死亡的首要原因[1，2, 3]。2008年，新诊断的肝细胞癌病人超过70万，按年龄 分层，每10万人中，就有新诊断的肝细胞癌病人16个[4]。经过仔细筛选的早期肿瘤病人， 通过肝切除术，肝移植和射频消融，可以得到有效的治疗[5]。但晚期肿瘤病人，因为术后复 发转移，预后依然很差[6]。因此，鉴定新的肝癌进展分子标记，并深刻理解肝癌术后转移复 发的分子机制，对于阻止肿瘤复发，延长患者生存依然十分重要。
[0003] 蛋白激酶B(ProteinkinaseB，PKB或AKT)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，与磷脂 酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)组成的PI3K/AKT信号通路广泛存 在细胞中，在凋亡、衰老、增殖等细胞生命活动中起重要作用[7]。非磷酸化AKT蛋白不具备 生物学活性，经磷酸化作用生成磷酸化AKT(PhosphorylatedAKT,pAKT)。
[0004] 粘蛋白属于一类高分子量糖蛋白家族，通常在胞浆或者细胞膜上，会被高度的0 型糖基化包被。通常生理条件下，大部分上皮细胞中具有粘蛋白的表达。近年来，很多文献 报道粘蛋白在炎症向肿瘤的进展过程中，起到了很重要的作用。粘蛋白MUC15最初是从牛 奶脂肪小泡的膜上被分离鉴定的，其基因定位于11号染色体短臂14. 3区[8]。MUC15的 mRNA在多种人类组织中通过逆转录PCR被检测到。在人类胎盘的发育过程中，MUC15的表 达在胚胎晚期比胚胎早期要高。最近有研究揭示，在肿瘤的发生发展及转移过程中，MUC15 可能发挥了潜在的作用。例如，在结肠腺癌中，MUC15的表达是异常升高的，并能促进人类结 肠癌细胞的恶性表型[9]。但是过表达外源的MUC15,能够抑制滋养层样细胞JAR和JEG-3 的侵袭能力[10]。
[0005] 然而，MUC15在肝癌发生发展及转移复发，以及肝癌术后预后评估中的作用等研 究，在国内外上仍是空白。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供MUC15与p-AKT联合应用作为肝癌预后评估标志物的用 途。
[0007] 在本发明的第一方面，提供MUC15蛋白和p-AKT蛋白的用途，用于制备进行肝细胞 癌预后评估的诊断试剂。
[0008] 在本发明的另一方面，提供一种用于肝细胞癌预后评估的试剂盒，所述试剂盒中 包括：
[0009] 特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂；和 [0010]特异性检测P-AKT蛋白表达水平的试剂。
[0011] 在一个优选例中，所述的试剂盒中，所述的特异性检测MUC15蛋白表达水平的试 剂是抗MUC15蛋白的抗体；和/或所述的特异性检测p-AKT蛋白表达水平的试剂是抗p-AKT蛋白的抗体。
[0012] 在另一优选例中，所述的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0013] 在另一优选例中，所述的抗MUC15蛋白的抗体是利用MUC15重组蛋白免疫兔子后 制备得到的。
[0014] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：携带有可检测信号分子的检测抗体。
[0015] 在另一优选例中，所述的可检测信号分子选自（但不限于）：辣根过氧化物酶、碱 性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、3 -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0016] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：免疫组化试剂。
[0017] 在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的免疫组化试剂包括（但不限于）：显色 试剂，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂。
[0018] 在本发明的另一方面，提供特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂和特异性检测 P-AKT蛋白表达水平的试剂的用途，用于制备肝细胞癌预后评估的试剂盒。
[0019] 在一个优选例中，所述的特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂是抗MUC15蛋白 的抗体；和/或所述的特异性检测P-AKT蛋白表达水平的试剂是抗p-AKT蛋白的抗体。
[0020] 在本发明的另一方面，提供一种肝癌预后评估的方法，所述方法包括：
[0021] (1)应用前面任一所述的试剂盒检测受试者离体肝癌组织中MUC15蛋白表达水平 和P-AKT蛋白表达水平；
[0022] (2)分析蛋白表达水平，
[0023] 若MUC15高表达且p-Akt低表达，则该受试者预后为低死亡率及低复发率；
[0024] 若MUC15低表达且p-Akt高表达，则该受试者预后为高死亡率及高发率；
[0025] 若MUC15和p-Akt均高表达或MUC15和p-Akt均低表达，则该受试者预后为中等 死亡率及中等复发率。
[0026] 在另一优选例中，所述肝癌预后评估方法包括以下步骤：
[0027] (a)利用所述试剂盒中的MUC15和p-AKT抗体和免疫组化实验试剂对切片后的肝 癌组织进行免疫组化染色；
[0028] (b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
[0029] (c)利用生物图像处理软件分析整张组织芯片阳性信号强度，给出评分；
[0030] (d)根据评分计算肿瘤组织中粘蛋白MUC15和p-AKT蛋白分子表达量；
[0031] (e)根据MUC15和P-AKT的表达量水平的负相关性，对肝癌患者预后进行评估。
[0032] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1、经p-AKT及MUC15双指标检测后的肝细胞癌组织分类及相应患者预后情况。
[0034] 图2、免疫组化显示肝癌组织中MUC15蛋白表达量显著低于对应的癌旁组织。
[0035] (A)肝癌（Tumor)及癌旁组织（Peri-tumor)中MUC15免疫组化结果；
[0036] (B) 313名患者肝癌及癌旁组织中MUC15表达量统计分析结果。
[0037] 图3、313个临床样本中MUC15与p-Akt存在明显负相关。r=-0. 185,p=0. 001。
[0038] 图4、临床样本中MUC15与p-Akt负相关典型图片。
[0039] 图5、结合MUC15和p-Akt显著增加了单独因素预测预后的效能。
【具体实施方式】
[0040] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现肝细胞癌中粘蛋白MUC15在癌中较癌 旁明显低表达。大样本验证发现，这种低表达与肝癌的恶性临床病理指标存在明显的相关 性。同时,本发明人将肿瘤样本中MUC15和p-AKT水平的负相关性结合起来，建立了一种肝 细胞癌的术后预后方法，该方法较应用MUC15或p-AKT单一因素具有更好的预后准确性。
[0041] 本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和计算机图像处理软件测定肿瘤组织中 MUC15与p-AKT蛋白的表达量，并结合术后随访信息，确定MUC15与p-AKT的负相关性可用 于判断手术后肝癌患者的预后效果，为肝癌病人术后监控与序贯治疗提供了重要的指导。
[0042] 为了准确地测定样本中MUC15和p-AKT蛋白的表达水平，本发明人建立了针对 MUC15和p-AKT蛋白的灵敏检测系统，从而有利于方便、快捷地用于临床检测。作为本发明 的优选方式，所述的检测系统是一种检测试剂盒，所述的试剂盒中含有特异性结合MUC15 和P-AKT蛋白的抗体。
[0043] 作为本发明的优选方式，所述的特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂是抗 MUC15蛋白的抗体；和/或所述的特异性检测p-AKT蛋白表达水平的试剂是抗p-AKT蛋白 的抗体。
[0044] 制备抗体的技术是本领域中众所周知的。本发明的抗体可以是对MUC15或p-AKT 蛋白具有特异性的单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备（见Kohler等 人，Nature256; 495, 1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol. 6:511，1976;Kohler等人，Eur. J.Immunol. 6:292, 1976;Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCell Hybridomas,Elsevier,N.Y. , 1981)。所述单克隆抗体可以利用MUC15或p-AKT蛋白或蛋白 片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合 成。
[0045] 本发明的抗体也可以是对MUC15或p-AKT蛋白具有特异性的多克隆抗体。所述的 多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的MUCl5或p-AKT蛋白导入动物 中来获得，例如，将MUC15或p-AKT蛋白与弗氏佐剂按照适当比例（如1:1)混合后免疫动 物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、牛等。作为本发明的优选方式， 采用兔来生产所述的多克隆抗体：兔免疫2-3个月后，从其静脉血中收获抗血清并纯化，获 得特异性多克隆抗体。
[0046] 在获得了特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂和特异性检测p-AKT蛋白表达水 平的试剂后，可以方便地制备出用于特异性检测MUC15和p-AKT蛋白的检测试剂盒。所述 试剂盒中除了含有所述抗体以外，还可以包含：携带有可检测信号分子的检测抗体（用于 与抗MUC15抗体或抗p-AKT抗体结合），以及疫组化试剂。所述的免疫组化试剂包括但不限 于：显色试剂，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂等。
[0047] 如本文所用，所述的"可检测信号分子"是指用于确定待检测样品中MUC15和 P-AKT蛋白的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的特异性 抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种可检测信 号分子。例如，可检测信号分子可以选自：辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酯酶（AP)、葡萄 糖氧化酶、P-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
[0048] 当采用如上所示的一些酶作为可检测信号分子时，还需要采用一些与相应的酶结 合的底物，从而可通过显色等方式来报导可检测信号分子的存在情况或者存在量。所述的 底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺（OPD)、四甲基联苯胺（TMB)、ABTS;用于碱性磷 酸酯酶的对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP);等等。本领域人员可根据 所采用的可检测信号分子的种类和特性，选择适宜的底物。
[0049] 在获得了本发明提供的试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中 MUC15和p-AKT蛋白的表达量，这些方法均被包含在本发明中。
[0050] 作为一种优选方式，本发明提供了使用上述试剂盒用于体外检测MUC15和p-AKT 蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤：
[0051] (a)利用所述试剂盒中的MUC15和p-AKT抗体和免疫组化实验试剂对切片后的肝 癌组织进行免疫组化染色；
[0052] (b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
[0053] (c)利用生物图像处理软件分析整张组织芯片阳性信号强度，给出评分；
[0054] (d)根据评分计算肿瘤组织中粘蛋白MUC15和p-AKT蛋白分子表达量。
[0055] 本发明人应用组织芯片免疫组织化学评分方法，对大量患者（313例）样本进 行了免疫组化分析，用ImageScope软件对组织芯片进行扫描，扫描后采用该软件的 Algorithms(PositivePixelCount)程序对每个芯片点进行"阳性Pixel"计算。如表1 计算数据。最终确定：MUC15高低表达标准可以以表达评分中位数（0. 35)为界限；p-AKT高 低表达标准可以以表达评分中位数（0.37)为界限。高于所述界限可确定为高表达，低于所 述界限可以确定为低表达。上述界限可以作为临床诊断的依据。
[0056] 综上，根据MUC15和p-AKT的表达量水平的负相关性，对肝癌患者预后进行评估。 本发明首次提出利用MUC15及p-AKT的负相关性进行检测并预测肝细胞癌手术后复发转移 等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
[0057] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0058] 实施例1、MUC15在肝癌及癌旁组织中的差异化表达
[0059] 1、临床组织样本的选取
[0060] 313例原发性肝细胞癌组织标本随机取自于2006年1月-2009年9月在第二军医 大学东方肝胆外科医院接受肝切除手术的HCC病人。书面知情同意书均于术前获得。入组 和排除的标准：术前体能评分WH00-1 ;肝功能Child-Pugh分级为A级；没有远处转移；无 肉眼可见腹水；无肝性脑病；术前未接受任何放化疗；均为根治性切除；所有病人术后病理 均证实为肝细胞癌。按照国际抗癌联盟（UICC)2002第六版进行?!分期。本研究313例 肝细胞癌患者中男性为281例，女性32例，男女比例为9:1 ;平均年龄49. 6± 10. 2岁，范围 21-83岁；本组病例均为HBsAg阳性（313/313);无围手术期死亡病例。
[0061] 实施例2、免疫组化法检测肝癌及癌旁组织中MUC15的表达情况
[0062] 对上述313例肝癌患者的癌及癌旁组织，进行MUC15免疫组化实验，结果表明肝癌 组织中MUC15蛋白的表达水平明显低于对应的癌旁组织（Peritumor)，如图2。
[0063] 实施例3、MUC15与p-AKT在肝癌患者中表达情况与预后的关联
[0064] 1、组织芯片的构建
[0065] 首先对上述313例病人的每一个供体蜡块进行切片和苏木素-伊红（HE)染色。显 微镜下对所需穿取的目标组织进行定位，分别选取有代表性的癌和癌旁组织各3个位点， 利用组织芯片制作仪依次从供体蜡块上穿取直径为Imm的组织芯，插入有240个点阵的受 体蜡块中，以m的厚度连续切片，所得的组织芯片的每个点都经过病理诊断。
[0066] 2、免疫组化（DAB法）步骤
[0067] (I) -20°C取组织块，石蜡包埋，切片。
[0068] (2)石蜡切片60°C烤箱过夜。
[0069] (3)切片脱腊、水合：二甲苯①IOmin-二甲苯②IOmin-二甲苯③lOmin-100% 乙醇 5min- 95% 乙醇 5min- 85% 乙醇 5min- 75% 乙醇 5min-双蒸水 5min。
[0070] (4) 3%H202甲醇液，室温放置20min，去除内源性过氧化物酶。
[0071] (5)双蒸水洗 5minX3 次。
[0072] (6)抗原修复：切片放入0?OlM柠檬酸盐缓冲液中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸 5min〇
[0073] (7)自然冷却至室温，双蒸水洗5minX3次。
[0074] (8) 1%BSA封闭 30min，37°C。
[0075] (9)甩去封闭液，不洗，直接加一抗（抗MUC15多克隆抗体或抗p-AKT多克隆抗 体），置入湿盒中30min，37°C，后4°C冰箱过夜。
[0076] (10)4°C取出，室温下复温 15min，0.01MPBS洗 5minX4 次。
[0077] (11)滴加DAKO二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体），湿盒中45min，37°C。
[0078] (12)0.01MPBS洗 5minX4 次，DAB显色 2-10min，镜下观察。
[0079] (13)双蒸水终止显色，0?OlMPBS洗5minXl次。
[0080] (14)苏木精-伊红或甲基绿复染2min，无水乙醇脱色5-10s。
[0081] (15)二甲苯脱水透明，滴中性树脂后盖玻片覆盖封片。
[0082] (16)显微镜下观察阳性染色。
[0083] 3、免疫组化结果判定方法
[0084] 组织芯片免疫组织化学评分方法：采用ImageScope(Aperio公司）软件对整张 组织芯片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(PositivePixelCount)程序对每个 芯片点进行"阳性Pixel"计算。获得计算数据如表1。
[0085] 表 1
[0086]
【权利要求】
1. MUC15蛋白和p-AKT蛋白的用途，用于制备进行肝细胞癌预后评估的诊断试剂。
2. -种用于肝细胞癌预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括： 特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂；和 特异性检测P-AKT蛋白表达水平的试剂。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性检测MUC15蛋白表达水平的 试剂是抗MUC15蛋白的抗体；和/或 所述的特异性检测P-AKT蛋白表达水平的试剂是抗P-AKT蛋白的抗体。
4. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括；携带有可检测信 号分子的检测抗体。
5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测信号分子选自；辣根过氧化 物酶、碱性磯酸醋酶、葡萄糖氧化酶、目-D-半乳糖巧酶、脈酶、过氧化氨酶、或葡萄糖淀粉 酶。
6. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括；免疫组化试剂。
7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的免疫组化试剂包括：显色试剂，二 甲苯，己醇，&〇2甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂。
8. 特异性检测MUC15蛋白表达水平的试剂和特异性检测P-AKT蛋白表达水平的试剂的 用途，用于制备肝细胞癌预后评估的试剂盒。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的特异性检测MUC15蛋白表达水平的试 剂是抗MUC15蛋白的抗体；和/或 所述的特异性检测P-AKT蛋白表达水平的试剂是抗P-AKT蛋白的抗体。
10. -种肝癌预后评估的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 应用权利要求2-7任一所述的试剂盒检测受试者离体肝癌组织中MUC15蛋白表达 水平和P-AKT蛋白表达水平； (2) 分析蛋白表达水平， 若MUC15高表达且p-Akt低表达，则该受试者预后为低死亡率及低复发率； 若MUC15低表达且p-Akt高表达，则该受试者预后为高死亡率及高发率； 若MUC15和p-Akt均高表达或MUC15和p-Akt均低表达，则该受试者预后为中等死亡 率及中等复发率。
【文档编号】G01N33/68GK104345152SQ201310345222
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月8日 优先权日:2013年8月8日
【发明者】王红阳, 陈磊, 王若愚 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院