药物活性成分筛选方法

文档序号:6174112
药物活性成分筛选方法
【专利摘要】一种药物活性成分的筛选方法,包括:1)初步确定药物活性成分:1.1)获取病理体的病理学药效指标;1.2)获取待确定药物活性成分的药物的最大药效点的时刻以及最小药效点的时刻;1.3)获取病理体的全血和/或体液;1.4)建立全指纹图谱;1.5)将全指纹图谱进行对比,全指纹图谱中反差最大的是初步确定的药物活性成分;反差最大是在最大药效时间点的全指纹图谱和最小药效时间点的全指纹图谱中色谱峰变化最大的部分;2)获取初步确定的药物活性成分;3)检测、筛选并确定药物活性成分。本发明提供了一种可准确以及快速地确定中药中活性成分的药物活性成分筛选方法。
【专利说明】药物活性成分筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学领域,涉及ー种药物活性成分的筛选方法,尤其涉及ー种以药效为导示以微乳为分离介质的药物活性成分筛选方法。
【背景技术】
[0002]中医药具有悠久的历史和显著的疗效,但中药的基础性研究比较薄弱,绝大多数中药的化学成分尚未触及,活性成分研究更是无从开展。其中制约中药在国际市场开拓和竞争的主要原因是缺乏行之有效的中药活性成分研究方法。现在普遍使用的研究方法是提取中药单一成分或抽提出某ー馏分,然后进行药理实验确定其活性成分,这种方法的研究层面和深度往往根据研究者的认知而受到局限,也同时大大降低了成功概率。
[0003]目前对中药活性成分筛选的研究策略和假说中最有代表性的是全成分论和活性成分论。全成分论认为传统中药之所以能产生疗效是其中所有化学成分均起作用,若将任何ー种成分去除都违背中医的整体观念。该理论的认识局限干“整体观念”,使中药中的活性成分开发思路变窄,活性成分论有两种观点:①血清药理学:1988年日本学者田代真一就提出了血清药理学,该理论基于人体研究,并认为药物若起到治疗作用必须能进入血液,所以这些成分才有可能是真正的活性成分,这一理论大大縮小了寻找中药活性成分的范围,但缺乏从含药血清中确定活性成分的方法;②传统天然药物化学法:即根据临床疗效有“针对性”的在体外对中药复方进行提取、分离、鉴定,从而得到其活性成分,但由于其不能还原真实的体内环境,且局限于人的认知范围,所以得到的活性成分难以实现原中药复方的全部功效,甚至出现药物作用和主治范围脱节,从而引起活性更强的成分被丢失等现象。既往文献报道活性成分都是通过血液运送到靶器官的,若中药复方能产生明确的疗效,可能是其所含的活性成分被转运到靶器官并与受体结合产生作用;若一个有效的中药复方用药后药效逐渐消失,可能是被转运到靶器官的活性成分由于代谢导致浓度下降而使药效消失。
[0004]不难发现,制约中药活性成分筛选的具体问题如下:①药物进入体内后所收集的生物体液样品大多需经过前处理,而前处理中极有可能顾此失彼:比如亲水性化合物和亲脂性化合物只能兼顾ー种,酸性化合物、碱性化合物以及中性化合物不能同时存在于生物体液样品。②药物进入体内后会根据内环境的不同而转变成不同性质的物质,或酸或碱或中性。现有技术造成物质分离參数的种类有限,难以将生物体液样本中的这些物质同时检测并有效分离,成为中药活性成分研究的瓶颈问题。只有应用新方法和新技术,加强中药活性成分研究,才能加速中药现代化步伐。

【发明内容】

[0005]为了解决【背景技术】中存在的上述技术问题,本发明提供了一种可准确以及快速地确定中药中活性成分的药物活性成分筛选方法。
[0006]本发明的技术解决方案是:本发明提供了一种药物活性成分筛选方法,其特殊之处在于:所述方法包括以下步骤:
[0007]I)初歩确定药物活性成分:
[0008]1.1)获取病理体的病理学药效指标;
[0009]1.2)根据步骤1.1)所得到的病理体的病理学药效指标获取待确定药物活性成分的药物的最大药效点的时刻以及最小药效点的时刻;
[0010]1.3)在待确定药物活性成分的药物的最大药效点的时刻以及最小药效点的时刻分别获取病理体的全血和/或体液;
[0011]1.4)根据微乳液相色谱法对步骤1.3)所得到的病理体的全血和/或体液分别建立全指纹图谱;
[0012]1.5)根据药效差示血清色谱法将步骤1.4)所建立得到的全指纹图谱进行对比,所述全指纹图谱中反差最大的是初步确定的药物活性成分;所述反差最大是在最大药效时间点的全指纹图谱和最小药效时间点的全指纹图谱中色谱峰变化最大的部分;
[0013]2)获取初步确定的药物活性成分;
[0014]3)检测、筛选并确定药物活性成分。
[0015]上述步骤1.1)的具体实现方式是:
[0016]1.1.1)建立病理体的病理模型;
[0017]1.1.2)对病理体注射待确定药物活性成分的药物;
[0018]1.1.3)根据常规检测手段检测已经注射待确定药物活性成分的药物的病理体的各项病理学药效指标。
[0019]上述步骤2)的具体实现方式是:
[0020]判断步骤I)所初步确定的药物活性成分是否是标准品;若是标准品,则直接采用标准品;若否,则采用常规技术手段制备步骤I)所初步确定的药物活性成分。
[0021]上述步骤3)的具体实现方式是:
[0022]判断步骤2)所获取初步确定的药物活性成分是否采用标准品,若是,则直接确认步骤2)所采用的标准品就是待确定药物的药物活性成分;若否,则根据常规技术手段检测、筛选并确定待测药物的药物活性成分。
[0023]上述方法在步骤3 )之后还包括:
[0024]4)对步骤3)所确定的药物活性成分进行验证。
[0025]上述步骤4)的具体实现方式是:将步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标与对病理体所注射的药物的药效学指标进行对比,若步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标不低于对病理体所注射药物的药效学指标的1/2,则确认步骤3)所得到的药物活性成分是对病理体所注射药物的药物活性成分;若步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标低于对病理体所注射药物的药效学指标的1/2,则重复步骤I)-步骤3),直至最終得到的药物活性成分的药效学指标不低于对病理体所注射药物的药效学指标的 1/2。
[0026]本发明的优点是:
[0027]本发明提供了以药效为导示以微乳为分离介质的药物活性成分筛选方法,用于捕捉药物的活性成分,即用血清物质谱的最大药效和最小药效之差捕捉伴随着药效消失而消失的活性成分,同时最大程度地分离、纯化、鉴定出这些活性成分是原方剂中含有的还是机体的代谢产物。然后采用对证模型验证,将药效结果不断反馈性调整差示色谱条件,直至确认活性成分。待活性成分确定后,以质谱及核磁共振波谱动态进行定性、定量中药体内活性成分的变化,并综合分析相应的药效指标,最终确认中药的活性成分。其中,本发明所采用的药效差示血清色谱法能够遵循病证结合、方证关联、药与证对应、理法方药统一的整体研究思路,尤其是能将复杂问题简单化,利用现代药理、药物分析等多种技术手段,对比相应机体血清化学组分数的变化差并确定活性成分,该方法能够比较科学、准确地筛选中药中的活性成分。本发明所采用的微乳液相色谱法的优点恰恰能弥补中药活性成分筛选中所存在的瓶颈问题,其具体优点如下:①.微乳可溶解蛋白,所以用微乳做流动相时可以实现直接进样分析生物体液样品。生物体液样本不仅真实再现了体内环境,而且包括了所有的活性成分。所以,以微乳为分离介质的流动相就为中药活性成分筛选三大难点之一:实现生物体液样本直接进样提供了理论支持。②.从微乳的微观结构来看,微乳液滴具有类生物膜的有序亲水区和疏水区结构,所以对对亲水性和亲脂性化合物均有较强的溶解能力。这就使微乳液相色谱法同时测定亲水性和亲脂性化合物变成了可能。③.在微乳流动相中,溶质与微乳液滴及固定相吸附层之间存在着疏水、氢键、静电等多种作用力,所以可调控参数较多,适用于中药中复杂混合物的分离。这就为中药活性成分筛选三大难点之一:药物活性成分能够同时达到有效分离提供了理论支持。微乳液相色谱法已在各种领域进行了推广使用。比如:申报新药中稳定性考察是一项重要内容,所建立方法必须能将合成的或者降解的杂质从主成分峰和辅料峰中分开且分离良好。而微乳液相色谱法以独特的分离选择性和广泛的适用性在稳定性考察中得到广泛应用,展现了微乳液相色谱法在稳定性研究中的极高潜力。
[0028]为了验证本发明所提供方法的可行性及科学性,前期采用药效差示血清色谱法成功确定了红花、丹参等代表性单味活血化瘀药材中改善血液流变学的活性成分。本发明将活性成分筛选单纯的应用于任何一种理论均难以实现对现有研究的突破,而应将药物分析与药效学研究“整合”起来。将药物分析与药效学有机整合,首创了以药效指标为导示来确定中药活性成分的药效差示血清色谱法。本发明能实现生物体液样品直接分析,并做到了尽可能还原活性成分所存在的内环境。
【具体实施方式】
[0029]本发明提供了一种药物活性成分筛选方法,该方法包括以下步骤:
[0030]I)初步确定药物活性成分:
[0031]1.1)获取病理体的病理学药效指标:
[0032]1.1.1)建立病理体的病理模型;
[0033]1.1.2)对病理体注射待确定药物活性成分的药物;
[0034]1.1.3)根据常规检测手段检测已经注射待确定药物活性成分的药物的病理体的各项病理学药效指标。
[0035]1.2)根据步骤1.1)所得到的病理体的病理学药效指标获取待确定药物活性成分的药物的最大药效点的时刻以及最小药效点的时刻;
[0036]1.3)在待确定药物活性成分的药物的最大药效点的时刻以及最小药效点的时刻分别获取病理体的全血和/或体液;[0037]1.4)根据微乳液相色谱法对步骤1.3)所得到的病理体的全血和/或体液分别建立全指纹图谱;
[0038]1.5)根据药效差示血清色谱法将步骤1.4)所建立得到的全指纹图谱进行对比,全指纹图谱中反差最大的是初步确定的药物活性成分;反差最大是在最大药效时间点的全指纹图谱和最小药效时间点的全指纹图谱中色谱峰变化最大的部分。
[0039]2)获取初步确定的药物活性成分:
[0040]判断步骤I)所初步确定的药物活性成分是否是标准品;若是标准品,则直接采用标准品;若否,则采用常规技术手段制备步骤I)所初步确定的药物活性成分。
[0041]3)检测、筛选并确定药物活性成分:
[0042]判断步骤2)所获取初步确定的药物活性成分是否采用标准品,若是,则直接确认步骤2)所采用的标准品就是待确定药物的药物活性成分;若否,则根据常规技术手段检测、筛选并确定待测药物的药物活性成分。
[0043]本发明所提供的方法在步骤3)之后还包括:
[0044]4)对步骤3)所确定的药物活性成分进行验证:
[0045]将步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标与对病理体所注射的药物的药效学指标进行对比,若步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标不低于对病理体所注射药物的药效学指标的1/2,则确认步骤3)所得到的药物活性成分是对病理体所注射药物的药物活性成分;若步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标低于对病理体所注射药物的药效学指标的1/2,则重复步骤I)-步骤3),直至最終得到的药物活性成分的药效学指标不低于对病理体所注射药物的药效学指标的1/2。
[0046]本发明的理论基础是:中药现代化的关键点是难以明确其中的活性成分,从而不能进ー步探讨中药的作用机制和代谢途径。阐明中药的药效物质基础,筛选活性成分,缺少的是行之有效的研究技木。目前,建立中药活性成分筛选关键技术的难点在于以下三点:①实现生物体液样本直接进样,以确保含有全部药物活性成分;②药物活性成分能够同时达到有效分离确定药物中的活性成分。
[0047]针对以上难点,本发明首次提出一种全新的研究方法一一药效差示血清色谱法。当中药在对证机体内产生药效学变化吋,机体血清中化学组份数相应的变化差中将最小范围而最大程度的包含着真正的活性成分。基于这种研究方法,成功确定了红花、丹參、等代表性活血化瘀单味药材中改善血液流变学的活性成分。研究结果表明:药效差示血清色谱法可解决中药活性成分筛选三大难点之一:确定药物中的活性成分。
[0048]以红花以及丹參为例对本发明进行详细说明:红花中的主要活性成分为羟基红花黄色素A,丹參中主要活性成分为丹酚酸B。对丹红注射液进行研究时发现:按照丹红注射液组方配比组合羟基红花黄色素A和丹酚酸B时,化药组合组的疗效并不及丹红注射液组(见表I)。这提示丹红注射液中还有其他活性成分,这些活性成分可能是丹參和红花中已经含有的,或者丹參和红花组合在一起发生化学反应时产生的新物质甚至是机体的代谢产物。这些活性成分未能被检测出的原因可能有以下两点:①样品的前处理步骤中将活性成分丢失。虽然现有方法已尽可能的简化前处理,但由于缺乏关键技术仍难以实现直接进样分析生物体液样品的目标,活性成分可能在前处理中已经丢失。②现有筛选技术尚不能实现同时对复杂混合物的有效分离。中药中成分复杂,亲水性、亲脂性化合物同时存在,现有筛选技术不具备既亲水又亲脂的溶解能力;中药中存在酸性、碱性以及中性等多种性质的化合物,现有筛选技术不能同时实现有效分离。
[0049]表I活性成分组对血瘀大鼠血液流变学的影响(? ±.5,η=8)
【权利要求】
1.一种药物活性成分筛选方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤: 1)初步确定药物活性成分: 1.1)获取病理体的病理学药效指标; 1.2)根据步骤1.1)所得到的病理体的病理学药效指标获取待确定药物活性成分的药物的最大药效点的时刻以及最小药效点的时刻; 1.3)在待确定药物活性成分的药物的最大药效点的时刻以及最小药效点的时刻分别获取病理体的全血和/或体液; 1.4)根据微乳液相色谱法对步骤1.3)所得到的病理体的全血和/或体液分别建立全指纹图谱; 1.5)根据药效差示血清色谱法将步骤1.4)所建立得到的全指纹图谱进行对比,所述全指纹图谱中反差最大的是初步确定的药物活性成分;所述反差最大是在最大药效时间点的全指纹图谱和最小药效时间点的全指纹图谱中色谱峰变化最大的部分; 2)获取初步确定的药物活性成分; 3)检测、筛选并确定药物活性成分。
2.根据权利要求1所述的药物活性成分筛选方法,其特征在于:所述步骤1.1)的具体实现方式是: 1.1.0建立病理体的病理模型; 1.1.2)对病理体注射待确定药物活性成分的药物; 1.1.3)根据常规检测手段检测已经注射待确定药物活性成分的药物的病理体的各项病理学药效指标。
3.根据权利要求1或2所述的药物活性成分筛选方法,其特征在于:所述步骤2)的具体实现方式是: 判断步骤I)所初步确定的药物活性成分是否是标准品;若是标准品,则直接采用标准品;若否,则采用常规技术手段制备步骤I)所初步确定的药物活性成分。
4.根据权利要求3所述的药物活性成分筛选方法,其特征在于:所述步骤3)的具体实现方式是: 判断步骤2)所获取初步确定的药物活性成分是否采用标准品,若是,则直接确认步骤2)所采用的标准品就是待确定药物的药物活性成分;若否,则根据常规技术手段检测、筛选并确定待测药物的药物活性成分。
5.根据权利要求4所述的药物活性成分筛选方法,其特征在于:所述方法在步骤3)之后还包括: 4)对步骤3)所确定的药物活性成分进行验证。
6.根据权利要求5所述的药物活性成分筛选方法,其特征在于:所述步骤4)的具体实现方式是:将步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标与对病理体所注射的药物的药效学指标进行对比,若步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标不低于对病理体所注射药物的药效学指标的1/2,则确认步骤3)所得到的药物活性成分是对病理体所注射药物的药物活性成分;若步骤3)所确定得到的药物活性成分的药效学指标低于对病理体所注射药物的药效学指标的1/2,则重复步骤I)-步骤3),直至最终得到的药物活性成分的药效学指标不低于对病理体所注射药物的药效学指标的1/2。
【文档编号】G01N30/34GK103439425SQ201310382294
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】王超, 文爱东, 吴寅, 贾艳艳, 肖茜, 杨志福, 杨静, 赵超, 李玉文, 贾娜, 李锐莉, 张维, 曹珊珊, 王璐, 崔佳 申请人:中国人民解放军第四军医大学
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