一种人α-乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种人α-乳清白蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人α-乳清白蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人α-乳清白蛋白单克隆抗体。本发明可用于转基因成分定量检测。该方法采用夹心ELISA法，敏感、特异、操作方便。CGMCC No745920130426
【专利说明】-种人a -乳清白蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体来说涉及人a -乳清白蛋白夹也化ISA检测试剂 盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 在转基因生物新品种培育重大专项和国家其他经费的资助下，我国转基因猪、牛 和羊新品种研发获得了蓬勃发展，多个转基因动物品种展示了良好的产业化前景，其中发 展最为迅速的是乳腺生物反应器的利用，目前转人a-乳清白蛋白基因奶牛已经通过了农 业部规定的中间试验、环境释放及生产性试验。
[0003] 由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理一直受到各国政府 的高度重视。牛奶和奶制品是人们餐桌上最常见的一类食物，食品安全直接关系民生，在 没有足够的数据证明其安全之前，质检机构均有责任和义务去检测和监测该些已上市或即 将上市的转基因产品。开发一种实用、灵敏、特异的人a-乳清白蛋白成分检测试剂十分必 要。
[0004] 目前用于检测a -乳清白蛋白的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、放 射性免疫法和酶联免疫吸附法等，但是检测人a-乳清白蛋白的报道却并不多。双抗体夹 也化ISA又称抗原捕捉化ISA，该方法已被大量用于动物疫病的临床诊断，该方法最关键的 条件是制备高纯度的包被抗体，纯度越高，则特异性越好，但尚无人a-乳清白蛋白转基因 成分双抗体夹也化ISA检测方法的报道。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明目的是提供一种人a-乳清白蛋白夹也 ELISA检测试剂盒。
[0006] 本发明另一目的是提供人a-乳清白蛋白夹也ELISA检测试剂盒检测人a-乳清 白蛋白的方法。
[0007] 本发明再一目的是提供人a -乳清白蛋白夹也化ISA检测试剂盒在检测转基因牛 奶及奶制品中人a-乳清白蛋白含量中的应用。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供了 一种人a -乳清白蛋白的夹也ELISA 检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人a-乳清白蛋白多克隆抗 体，所述酶标抗体为人a-乳清白蛋白单克隆抗体。
[0009] 其中，所述人a -乳清白蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0:7459的杂交瘤细 胞株分泌获得。
[0010] 杂交瘤细胞ZZY hLY7El，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中也 (简称CGMCC，地址；北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编 码；100101)，保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCC No. 7459。
[0011] 用原核表达重组蛋白hLA免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞 融合，经化ISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLA的 1株细胞7E1。取杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得单克隆抗体。
[0012] 细胞7E1能与免疫原hLA反应，不与筛选原牛a-乳清白蛋白（bLA)反应。Western Blot检测显示抗体7E1只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。
[0013] 其中，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
[0014] 其中，所述人a-乳清白蛋白多克隆抗体是W人a-乳清白蛋白作为免疫抗原，分 批次免疫正常家兔，加强免疫后7天收集血清，分离纯化得到。
[0015] 纯化抗体通过考马斯亮蓝验证，多克隆抗体能满足要求，浓度约为Img/mL。采用间 接化ISA法对抗体IgG进行鉴定，抗体效价达到1 : 200, 000。
[0016] 其中，检测样本中免疫抗原检测限为250ng/mL。
[0017] 进一步地，所述人a -乳清白蛋白的夹也化ISA检测试剂盒还包括W下试剂中的 一种或几种：
[001引 1)洗徐液;
[001引 2)底物显色液；
[0020] 3)反应终止液；
[0021] 4)人a-乳清白蛋白标准品。
[0022] 更进一步地，所述洗涂液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为 2mol/L H2SO4。
[0023] 本发明还提供了前述试剂盒检测人a -乳清白蛋白的方法，包括如下步骤：
[0024] 1)向包被人a -乳清白蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人a -乳清白蛋白抗原标 准品和待检测样品，洗涂液洗板；
[002引 2)加入酶标人a -乳清白蛋白单克隆抗体，洗涂液洗板；
[0026] 3)加入底物显色液显色，加入反应终止液终止反应，测定0D450值；
[0027] 4) W人a-乳清白蛋白抗原标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人 a-乳清白蛋白的含量。
[0028] 本发明还提供了前述试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人a -乳清白蛋白含 量中的应用。
[0029] 具体包括W下步骤：
[0030] I I gG标准曲线的建立：
[0031] 将人a-乳清白蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗 板；加入不同浓度的人a-乳清白蛋白抗原标准品溶液，洗板；加入酶标人a-乳清白蛋白 单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，W与阴性对照孔0D值的比值大 于2. 1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；
[0032] II检测样品中人a-乳清白蛋白的含量：
[0033] 将人a-乳清白蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗 板；加入待检测样品，洗板；加入酶标人a-乳清白蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终 止反应；测定0D450值，通过与标准曲线比对，定量检测人a -乳清白蛋白。
[0034] 优选地，人a -乳清白蛋白多克隆抗体浓度为20y g/mU包被液为抑9. 6磯酸缓冲 液，酶标人a-乳清白蛋白单克隆抗体稀释倍数为1:500。
[0035] 具体实施步骤如下：
[0036] 1、IgG标准曲线的建立：
[0037] (1)包被；浓度为20 y g/mL兔多克隆抗体，100 y L/孔，4°C过夜，洗液洗涂3次； [003引（2)封闭；加150 uL/孔封闭液，37C 2小时后，洗涂3次，拍干，置4C冰箱保存备 用；
[0039] (3)加标准样品：
[0040] 混合转基因样品和非转基因样品制备人a -乳清白蛋白抗原标准品，标准品原始 浓度为2mg/mL，分别按照1:2、1: 4、1:8、1:16、1:32、1:64稀释，PBS作为阴性对照；加入不同 浓度的人a-乳清白蛋白抗原标准品溶液100 UL/孔，37C赔育30min，洗板4次，拍干；
[0041] (4)加二抗：小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37C赔育 20min，洗板4次，拍干；
[0042] (5)显色；TMB 按 lOOy L/孔加入，37°C显色 15-30min ;
[004引 （6)终止；加入终止液2M恥0450 y L/孔；
[0044] (7)读数；W 450皿单波长测定各孔0D值，W与阴性对照孔0D值的比值大于2. 1 为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线。
[0045] 2、检测样品中人a-乳清白蛋白的含量：
[0046] (1)包被；浓度为20 y g/mL兔多克隆抗体，100 y L/孔，4°C过夜，洗液洗涂3次；
[0047] (2)封闭；加150 uL/孔封闭液，37C 2小时后，洗涂3次，拍干，置4C冰箱保存备 用；
[0048] (3)加待测样品：
[0049] 加入待测样品，lOOy L/孔，37C赔育30min，洗板4次，拍干；
[0050] (4)加二抗：小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37C赔育 20min，洗板4次，拍干；
[0051] (5)显色；TMB 按 lOOy L/孔加入，37°C显色 15-30min ;
[0052] (6)终止；加入终止液2M H2SO45O y L/孔；
[005引 （7)读数：W 450nm单波长测定各孔0D值，通过与标准曲线比对，定量检测人 a-乳清白蛋白。
[0054] 本发明的有益效果；本发明的人a-乳清白蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏 度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，可直接对外源表达蛋白进行检测， 同时避免了核酸检测方法中，基因提取费时费力且容易污染的问题。本发明可用于转基因 牛奶及奶制品中人a-乳清白蛋白的定量检测，根据标准曲线在250?2000ng/mL范围内 线性良好，可实现对样品的高特异性和高灵敏度检测，检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠， 而且可W稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[00巧]图1为免疫抗原（6his-MBP-CCG343)及检测抗原（PGEX-6P-1-CCG343)的表达纯 化；
[0056]其中，la ;化is-MBP-CCG343 样品；化：化is-MBP-CCG343 穿柱液；Ic ; 化is-MBP-CCG343 洗脱 1 ;ld ;化is-MBP-CCG343 洗脱 2 ;2a ;PGEX-6P-1-CCG343 样品；2b ; PGEX-6P-1-CCG343 穿柱；2c ;PGEX-6P-1-CCG343 洗脱 1 ;2d ;PGEX-6P-1-CCG343 洗脱 2 ;
[0057] 图2为实施例2Western-blot检测结果图；
[0058] 其中，1 为 PGEX-6P-1-CCG343 ;2 为化is-MBP-CCG343 ;
[0059] 图3为杂交瘤细胞上清与样品Wester-blot试验结果；
[0060] 其中，3;转人乳铁蛋白基因奶牛牛奶样品；5;牛乳清白蛋白；4;转人a-乳清白 蛋白基因奶粉样品；
[0061] 图4为转基因牛奶及奶粉样品Western Blot检测；
[0062] 其中，1;转人a-乳清白蛋白基因牛奶样品；2;转人a-乳清白蛋白基因奶粉样 品；3合元极致牛奶样品；4 ;人a -乳清白蛋白；5 ;牛a -乳清白蛋白；6合元极致牛奶样 品；
[0063] 图5为转基因牛奶样品的检测标准曲线。
【具体实施方式】
[0064] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0065] 转人a-乳清白蛋白基因奶牛样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实 验室；单克隆抗体和多克隆抗体由中国检验检疫科学研究院动检实验室构建；日本大耳白 兔购自军事医学科学研究院实验动物中也；人a -乳清白蛋白购自Sigma公司。
[0066] 酶标板购自宏捷成生物公司；HRP标记试剂盒（CatNo31488)购自Pierce公司；山 羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥生物公司；TMB (可溶型）购自天根生 物公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、96孔酶标板购自北京宏捷成生物科技有限公司； IgG纯化试剂盒购自嘉兴行建生物科技有限公司，石蜡油购自BBI公司。
[0067] 层析柱购自化amacia公司；润旋仪购自江苏海口市其林贝尔公司；高速微量离也 机购自美国Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM纯水系统购自美国Millipore公司；舒适 性恒温仪购自eppendcxrf公司；台式冷冻离也机、真空浓缩仪购自eppendcxrf公司；电热恒 温水浴锅购自PolyScience公司；Nano化oplOOO紫外/可见分光光度计购自Nano化op公 司；恒温鼓风干燥箱、摇床购自中国智成公司；紫外凝胶成像系统购自UVP公司；PYY-6C型 稳压稳流电泳仪、DYCP-31C微型水平电泳槽购自北京六一厂；高压灭菌锅、-8(TC冰箱购自 日本H洋公司；混合型球磨仪购自Retsch公司；酶标仪，BI0-RAD。
[0068] 转基因牛奶、奶粉样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，非转基 因牛奶及脱脂奶粉购自超市。
[0069] 实施例1原核表达人a -乳清白蛋白
[0070] 1、委巧宝生物工程(大连）有限公司合成429bp的人a-乳清白蛋白基因连接到 pMBP和PGEX-6P-1载体，分别命名为化is-MBP-CCG343和PGEX-6P-1-CCG343,表达并纯化 两种蛋白，其中化is-MBP-CCG343为制备单克隆抗体的免疫抗原，PGEX-6P-1-CCG343为制 备单克隆抗体的检测抗原，蛋白纯化见图1。其中洗脱1+洗脱2作为免疫抗原，共lOmL (0. 8mg/ml)，洗脱1+洗脱3作为检测抗原共4mL (0. 7mg/ml)
[0071] 实施例2制备人乳清白蛋白多克隆抗体，并对原核表达的两种蛋白进行验证
[0072] 1、兔免疫血清的制备
[0073] 选择同一批次健康的雌性日本大耳白兔4只，随机分为2组，实验组和对照组，实 验组3只免疫hLA (sigma),对照组1只用PBS缓冲液代替hLA免疫，每只兔子皮下注射总 量为2mL用佐剂乳化好的抗原，每只兔子5mg，在第3次加强免疫，每只兔子5mg，后7天，耳 静脉采血，检测血清中抗体滴度（间接化ISA法)，如滴度未达到1:10 4, 0D1.0 W上，则再加 强免疫。在抗体滴度已达到1: 1〇4后的第10天，也脏采集兔血，分离血清，-2(TC保存备用。 [0074] 2、多克隆抗体的提取
[00巧]采用IgG的纯化提取试剂盒，按说明书提取血清中的IgG，具体操作如下：
[007引 （1) 10血平衡缓冲液平衡柱子，流速为1血/min ;
[0077] (2) 1血注射器将抗体推入纯化柱中上样；
[0078] (3) lOmL的结合缓冲液冲洗柱子，流出的液体收集在EP管中；
[0079] (4) 4mL洗脱液进行洗脱，每血洗脱蛋白加0. 1血中和缓冲液。
[0080] (5)收集的液体用考马斯亮蓝测定浓度，-2(TC储存备用。
[0081] 纯化结果通过考马斯亮蓝验证，洗脱管2和洗脱管3能满足要求，浓度约为2mg/ mL。
[0082] 3、多克隆抗体与原核表达载体Western-blot试验
[0083] 选择1号管和2号管的兔血清分别与PGEX-6P-1-CCG343和化is-MBP-CCG343进 行Western-blot试验，结果在相应位置均有目的条带，见图2。
[0084] 由于多克隆抗体的免疫抗原与原核表达的抗原来源不同，前者来源于人奶(产品 编号L7269 I CAS号9051-29-0 I Sigma)此结果证实表达的抗原具有结合相应抗体的能力，可 用于制备单克隆抗体，前期工作中也尝试使用编号为L7269的抗原制备单克隆抗体，但结 果未筛选到特异性的单克隆抗体，所W后期使用原核表达的抗原制备单克隆抗体。
[0085] 实施例3单克隆抗体抗体的制备 [008引1、小鼠抗体的制备
[0087] 选择6周龄同一批次健康的雌性Ba化/c小鼠10只作为实验动物，随机分为2组， 实验组5只（1#、2#、3#、4#、5#小鼠)，对照组2只。实验组用化13-18?-〇：6343作为免疫 原进行免疫，用PBS缓冲液代替hLA进行免疫作为阴性对照。每只小鼠皮下注射总量为 100 y L用佐剂乳化好的抗原（250 y LPBS溶解Img抗原后与250 y L弗氏不完全佐剂混合， 共500 y L，每只小鼠注射100 y L)。第一次基础免疫剂量为每只小鼠200 y g，加强免疫免 疫剂量为每只小鼠200 y g，基础免疫时使用弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用弗氏不完全 佐剂乳化。基础免疫后间隔10天进行加强免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加强免疫后7 天，尾静脉采血，检血清中抗体滴度（间接ELISA法)，如滴度未达到1:10 4，0D1. 0 W上，则 再加强免疫。在抗体滴度达到1: 1〇4后的第10天眼眶采血，分离血清，-2(TC保存备用。 [008引 2、间接ELISA法检测免疫小鼠的抗体水平
[0089] W PGEX-6P-1-CCG343作为包被抗原，包被浓度；10 y g/mU利用间接化ISA法检测 血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为；1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、 1:240000、1:720000 ;对照组血清 1:3000 稀释。
[0090] hLA间接ELISA法测定的基本操作步骤如下：
[0091] (1)包被；将PGEX-6P-1-CCG343用包被液(磯酸缓冲液抑9. 6)稀释至10 y g/mL， 用微量加样器吸取稀释后的抗原加入96孔酶标板，100 y L/孔，置4°C冰箱过夜；
[0092] (2)洗涂；取出ELISA板，弃去孔内液体，在纸巾上轻轻叩打W除去残留液体，加入 PBST洗涂液，300 y L/孔，静置Imin，重复操作3?5次；
[009引 （3)封闭；用微量加样器按200 y L/孔加1%BSA，放入37C温箱化；
[0094] (4)洗涂；同步骤2);
[009引（5)加待检样本；用PBS缓冲液将血清稀释，血清稀释倍数依次为；1:400、1:800、 1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600 ;放入 37C温箱比；
[009引 （6)洗涂；同步骤2);
[0097] (7)加酶标抗体；用PBST洗涂液将HRP标记的山羊抗小鼠二抗稀释到工作浓度 1:5000,每孔加 100 y L，37°C温箱赔育 45min ;
[009引 （8)洗涂；同步骤2);
[0099] (9)加底物溶液；避光按100 y L/孔加入TMB底物溶液，室温赔育15min ;
[0100] (10)终止反应：室温下加终止液50 y L/孔，终止反应；
[0101] (11)测0D450值；检测450皿波长下的0D值，检测结果见表1。
[0102] 表1.经H次免疫后小鼠血清效价的测定结果
[0103]
【权利要求】
1. 一种人a-乳清白蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中， 所述包被抗体为人a-乳清白蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人a-乳清白蛋白单克隆 抗体。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人a _乳清白蛋白单克隆抗体由保 藏号为CGMCC NO:7459的杂交瘤细胞株分泌获得。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化 物酶。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂中的一种或 几种： 1) 洗涤液； 2) 底物显色液； 3) 反应终止液； 4) 人a-乳清白蛋白标准品。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为 TMB，所述反应终止液为2mol/L H2S04。
6. 利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测人a-乳清白蛋白的方法，包括如下步 骤： 1) 向包被人a-乳清白蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人a-乳清白蛋白标准品和待 检测样品，洗涤液洗板； 2) 加入酶标人a -乳清白蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板； 3) 加入底物显色液显色，加入反应终止液终止反应，测定0D450值； 4) 以人a-乳清白蛋白标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人a-乳清白 蛋白的含量。
7. 权利要求1-5任一项所述的试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人a-乳清白蛋白 含量中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK104422776SQ201310395795
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】林祥梅, 朱振营, 王勤, 刘建, 付伟, 孙敏, 王燕 申请人:中国检验检疫科学研究院