一种测定Kappa游离轻链浓度的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定Kappa游离轻链浓度的试剂盒及方法。该试剂盒包括反应缓冲液和Kappa游离轻链抗体溶液，所述的反应缓冲液中氯化钠的浓度为1250～2400mmol/L。本发明的试剂盒解决了Kappa游离轻链比浊测定中的临床标本线性差的问题，为临床医生提供可靠的Kappa游离轻链测定结果作为诊断参考，以便充分发挥胶乳增强免疫比浊方法速度快，通量高的优势，缩短检测时间，利于临床应用和病人诊断。
【专利说明】一种测定Kappa游离轻链浓度的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种测定Kappa游离轻链浓度的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]免疫球蛋白(Ig)轻链分为K (kappa)和λ (lambda) 2个型别，每个Ig分子上只有一个型别的轻链，人类K (kappa)和λ (lambda)的比例为6:4。轻链为能自由通过肾小球基底膜的小分子蛋白质，在肾小管被重吸收回到血液循环中，所以正常人尿中只有少量轻链存在。当人体发生代谢失调和多发性骨髓瘤时，血液中出现大量游离轻链，并由尿中排出，即为Bence-Jones蛋白(本周蛋白)。在正常人体内，血清κ型游离轻链为3?19mg/L, λ型游离轻链为6?26mg/L, κ/λ比值为0.26?1.65。异常情况的κ型游离轻链以及和K/λ比值、或异常λ型游离轻链和K /λ比值、或同时三者均异常等情况，对单克隆性Y球蛋白增多症(monoclonal gammopathies, MGP)的敏感性为88%?98% ;对非分泌性骨髓瘤(nonsecretory myeloma, NSM)的敏感性为65%?70%,有助于单克隆轻链病、AL-淀粉样变的早期诊断，也可用于化疗或自身外周血干细胞移植后是否复发的监测，如果化疗或移植效果好，则病患血清K型游离轻链、λ型游离轻链以及K/λ比值均在正常水平或相比治疗前有明显改善。
[0003]胶乳增强比浊方法可在全自动生化仪上测定K型游离轻链，速度快、通量高。对于游离轻链的测定，国内目前主要使用英国Binding site公司的Freelite系列测定试剂，可以通过胶乳增强比池方法测定Kappa游离轻链；但在临床应用中，Freelite系列试剂存在大量的临床标本稀释不成线性问题，这些标本测定结果明显不符合临床症状，目前在国内医院推广应用很有限。(注:稀释成线性是指按照一定比例手工使用生理盐水稀释临床标本，测定稀释后标本的结果应该与按照原始浓度和稀释比例计算的理论结果偏差在正负20%以内。线性也为体外诊断试剂的注册基本要求之一，通常稀释不成线性的标本结果是不可靠的。造成线性问题的主要原因有试剂配方抗血液成分干扰问题、抗体特异性问题等
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[0004]同时，发明人使用按照常规方式制备的Kappa游离轻链试剂，在未使用该特殊发明方法时也出现与Freelite试剂类似的临床标本稀释不成线性问题情况；由于不论是Freelite系列Kappa游离轻链测定试剂还是发明人自行制备的Kappa游离轻链试剂,均存在临床标本稀释不成线性问题，因此，可以认为临床标本稀释是否成线性是Kappa游离轻链比浊测定试剂盒制备中一大共同难点。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有的Kappa游离轻链测定不成线性的缺陷，提供了一种测定Kappa游离轻链浓度的试剂盒及方法。本发明的测定方法可以得到可靠的Kappa游离轻链测定结果。[0006]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:
[0007]本发明提供了一种采用胶乳增强比浊方法测定Kappa游离轻链浓度的试剂盒，其包括反应缓冲液(Rl试剂)和Kappa游离轻链抗体溶液(R2试剂)，其特征在于，所述的反应缓冲液中氯化钠的浓度为1250?2400mmol/L。
[0008]其中，所述的Kappa游离轻链抗体溶液中的Kappa游离轻链抗体较佳地为兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体,更佳地为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体(即Dako 公司的 Polyclonal Rabbit Ant1-Human Kappa Free Light Chains,货号为 A0100)。
[0009]较佳地，当反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化钠1250 ?2400mmol/L、吐温-20lml/L 和防腐剂 Proclin-3000.3ml/L 时，Kappa 游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体(货号为AOlOO)0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温-20lml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L。上述组成中，胶乳微球可购于国际知名胶乳供应商，如Bangslab公司或JSR公司。
[0010]更佳地，当反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化钠1250mmol/L、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L时，Kappa游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体(货号为A0100) 0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温-201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L ;或，当反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化钠2000mmol/L、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L时，Kappa游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体(货号为A0100) 0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L ;或，当反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) IOOmmol/L、氯化钠 1500mmol/L、吐温 _201ml/L 和防腐剂 Proclin-3000.3ml/L 时，Kappa 游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体(货号为A0100) 0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温-20lml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L ;或，当反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化钠2400mmol/L、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L时，Kappa游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体(货号为A0100) 0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L。上述组成中，胶乳微球可购于国际知名胶乳供应商，如Bangslab公司或JSR公司。
[0011]本发明还提供了一种测定Kappa游离轻链浓度的方法，其包括下述步骤:采用胶乳增强比浊方法，将待测样品与上述反应缓冲液和Kappa游离轻链抗体溶液混合后，计算吸光度变化ΛΑ，与标准品的工作曲线比较即可得到待测样品的Kappa游离轻链浓度，其特征在于，待测样品与反应缓冲液和Kappa游离轻链抗体溶液混合后的混合体系的氯化钠浓度为 1000 ?1600mmol/Lo
[0012]本发明中，所述的胶乳增强比浊方法是指一种在全自动生化仪上测定Kappa游离轻链浓度的常用方法，一般在相同的基本参数下(波长、方法学、样本试剂比例、反应时间)，先使用确定浓度的标准品在全自动生化仪使用对应的测定试剂进行校准测试，得到对应的测定试剂的校准曲线(工作曲线)，然后，使用相同的测定试剂，在全自动生化仪上测试待测样品，由全自动生化仪对照校准曲线自动计算出待测样品中被测物含量；具体操作可参见《全国临床检验操作规程第三版》(东南大学出版社，书号:9787564105839，2006年11月)及各仪器使用说明书。
[0013]其中，所述的全自动生化仪较佳地为型号为Olympus AU480或Hitachi7170的全
自动生化仪。
[0014]其中，所述的反应缓冲液可为本领域Kappa游离轻链浓度测定方法中胶乳增强比浊方法常用的反应缓冲液(Rl试剂);所述的Kappa游离轻链抗体溶液可为本领域Kappa游离轻链浓度测定方法中胶乳增强比浊方法常用的Kappa游离轻链抗体溶液(R2试剂)。
[0015]其中，所述的Kappa游离轻链抗体溶液中的Kappa游离轻链抗体较佳地为兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体,更佳地为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体(即Dako 公司的 Polyclonal Rabbit Ant1-Human Kappa Free Light Chains,货号为 A0100)。
[0016]较佳地，当反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化钠1250 ?2400mmol/L、吐温 _201ml/L、防腐剂 Proclin-3000.3ml/L 时，Kappa 游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体(货号为AOlOO)0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温-201ml/L、防腐剂Proclin-3000.3ml/L。上述组成中，胶乳微球可购于国际知名胶乳供应商,如Bangslab公司或JSR公司。
[0017]其中，所述的吸光度变化ΛΑ可由下述方法得到:将待测样品与反应缓冲液混合后，37°C恒温5分钟，再加入Kappa游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A1 ;37°C恒温4分30秒，测定吸光度为A2,计算吸光度变化Λ A=A2-Ap
[0018]其中，所述的工作曲线可由下述方法得到:将确定浓度的标准品与反应缓冲液混合后，37°C恒温5分钟，再加入Kappa游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为Atll ;37°C恒温4分30秒，测定吸光度为Atl2，计算吸光度变化AAci=Aci2-Atll,以AAtl与标准品的确定浓度作图，即可。
[0019]其中，所述的混合体系的氯化钠浓度较佳地为1300mmol/L。
[0020]其中，所述的待测样品较佳地为血清和/或骨髓分离血清。
[0021]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0022]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0023]本发明的积极进步效果在于:
[0024](I)本发明解决了 Kappa游离轻链比浊测定中的临床标本线性差的问题，为临床医生提供可靠的Kappa游离轻链测定结果作为诊断参考，以便充分发挥胶乳增强免疫比浊方法速度快，通量高的优势，缩短检测时间，利于临床应用和病人诊断。
[0025](2)该发明使用的方法简单有效，原料无毒且方便购买，利于生产放大和推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为Α-a试剂盒的工作曲线。
[0027]图2为Α-b试剂盒的工作曲线。
[0028]图3为Β-a试剂盒的工作曲线。
[0029]图4为Β-b试剂盒的工作曲线。
[0030]图5为A试剂盒的工作曲线。【具体实施方式】
[0031]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0032]下述实施例中的全自动生化仪为型号为Olympus AU480的全自动生化仪。
[0033]本发明采用胶乳增强比浊方法在全自动生化仪上测定K型游离轻链浓度的操作可参见《全国临床检验操作规程第三版》(东南大学出版社，书号:9787564105839，2006年
11月)。
[0034]A试剂盒(购于上海艾柯特医疗产品有限公司)中的反应缓冲液(Rl试剂)和Kappa游离轻链抗体溶液(R2试剂)的组成如下:
[0035]A试剂盒中反应缓冲液(Rl试剂)的组成
[0036]
【权利要求】
1.一种采用胶乳增强比浊方法测定Kappa游离轻链浓度的试剂盒，其包括反应缓冲液和Kappa游离轻链抗体溶液，其特征在于，所述的反应缓冲液中氯化钠的浓度为1250~2400mmol/Lo
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的Kappa游离轻链抗体溶液中的Kappa游离轻链抗体为兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的Kappa游离轻链抗体溶液中的Kappa游离轻链抗体为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，当所述的反应缓冲液的组成为4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化钠1250~2400mmol/L、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L时，所述的Kappa游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温-20lml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，当所述的反应缓冲液的组成为4-羟乙基哌嗪乙磺酸 100mmol/L、氯化钠 1250mmol/L、吐温 _201ml/L 和防腐剂 Proclin_3000.3ml/L时，所述的Kappa游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体 0.5mg/ml、胶乳微球 3mg/ml、吐温 _201ml/L 和防腐剂 Proclin-3000.3ml/L ;或，当所述的反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化钠2000mmol/L、吐温-201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L时，所述的Kappa游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L ;或，当所述的反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸 100mmol/L、氯化钠 1500mmol/L、吐温 _201ml/L 和防腐剂 Proclin-3000.3ml/L 时，所述的Kappa游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L ;或，当所述的反应缓冲液的组成为4-轻乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化钠2400mmol/L、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L时,所述的Kappa游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游离轻链抗体0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温_201ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L。
6.一种测定Kappa游离轻链浓度的方法，其包括下述步骤:采用胶乳增强比浊方法，将待测样品与如权利要求1~5中任一项所述的反应缓冲液和Kappa游离轻链抗体溶液混合后，计算吸光度变化ΛΑ，与标准品的工作曲线比较即可得到待测样品的Kappa游离轻链浓度，其特征在于，待测样品与反应缓冲液和Kappa游离轻链抗体溶液混合后的混合体系的氯化钠浓度为1000~1600mmol/L。
7.如权利要求6所述的测定Kappa游离轻链浓度的方法，其特征在于，所述的吸光度变化ΛΑ由下述方法得到:将待测样品与反应缓冲液混合后，37°C恒温5分钟，再加入Kappa游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A1 ;37°C恒温4分30秒，测定吸光度为A2,计算吸光度变化AA=A2-A115
8.如权利要求6所述的测定Kappa游离轻链浓度的方法，其特征在于，所述的工作曲线由下述方法得到:将确定浓度的标准品与反应缓冲液混合后，37°C恒温5分钟，再加入Kappa游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A01 ;37°C恒温4分30秒，测定吸光度为AQ2，计算吸光度变化Λ Aci=Aci2-Atll，以AAtl与标准品的确定浓度作图，即可。
9.如权利要求6所述的测定Kappa游离轻链浓度的方法，其特征在于，所述的混合体系的氯化钠浓度为1300mmol/L。
10.如权利要求6所述的测定Kappa游离轻链浓度的方法，其特征在于，所述的待测样品为血清和/或骨髓分离血`清。
【文档编号】G01N33/68GK103728455SQ201310396461
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】王金凤, 蒋欣 申请人:柏荣诊断产品（上海）有限公司