微流体装置和通过使用该微流体装置富集靶细胞的方法

微流体装置和通过使用该微流体装置富集靶细胞的方法
【专利摘要】本发明提供一种微流体装置，其能够安装在旋转驱动单元上。当安装在旋转驱动单元上并且旋转时，在该装置中由于离心力而引起流体流动。该微流体装置包括：样品供给单元，包括用以容纳样品的样品室并且提供包括靶材料的流体，在靶材料中细颗粒与样品中的靶细胞结合；密度梯度分离单元，容纳具有比靶材料低的密度的密度梯度材料，并且从样品供给单元接收流体以基于密度差异从流体分离靶材料；流体供给通道，将样品供给单元连接至密度梯度分离单元以形成流体的通道；以及流体供给阀，设置于流体供给通道以选择性地允许流体流动。
【专利说明】微流体装置和通过使用该微流体装置富集靶细胞的方法
【技术领域】
[0001]本公开涉及用于分离生物样品中的靶细胞的微流体装置和通过使用该微流体装置富集靶细胞的方法。
【背景技术】
[0002]由恶性肿瘤引起的病人的死亡主要是因为肿瘤从肿瘤最初发生的位置转移到其他组织或者器官。因此，为了增加生存机会，非常重要的是早发现肿瘤转移，早发现肿瘤并监测肿瘤的生长被认为是病人成功治疗的主要因素。通常，癌症通过组织病理学来诊断。组织病理学是使用从活检标本获得的组织样品直接识别肿瘤细胞的诊断方法。然而，被选择来获得活检标本样品的组织可能不包含肿瘤，由于仅提供从活检标本获得的关于特定位置的数据，所以识别肿瘤向其他位置的转移是相当受限的。因此，在肿瘤的诊断或监测中使用组织病理学具有许多限制。
[0003]在最初检测到肿瘤之前，可以在病人中识别循环肿瘤细胞(CTC)，CTC在早期诊断癌症中可以扮演重要因素。此外，由于在大多数情况下癌症通过血液扩散，CTC可以是用于识别癌症转移的标志物。此外，CTC甚至可以在通过外科手术去除癌细胞之后被检测到，在这种情况下，再发生癌症的可能性非常高。然而，由于在血液中的CTC的量可能是非常少的(例如，每HiL的血液有几个CTC细胞)且CTC非常脆弱，因此难以正确地识别CTC的数量。因此，需要开发一种对于检测病人身体中存在的CTC、癌细胞或癌症干细胞具有高灵敏度的诊断方法。为了获得用于准确检测的足够量的CTC细胞，还需要能够处理相对大量(例如，达到大约20mL)的血液的装置。
[0004]红血球、白血球/循环肿瘤细胞或血清可以根据密度梯度而手动地分离，以便隔离CTC、癌细胞或癌症干细胞。然而，白血球/循环肿瘤细胞的层非常薄，因此基于密度梯度而手动地分离白血球/循环肿瘤细胞的层是困难的，而且分离重复性很大程度上取决于执行分离的人员的能力。

【发明内容】

[0005]提供微流体装置和通过使用该微流体装置富集靶细胞的方法，该微流体装置根据自动工艺分离并且富集生物样品中的靶细胞。
[0006]附加的方面将在以下的描述中部分地阐述，并且将部分地从该描述而显见，或者可以通过给出的实施方式的实施而习知。
[0007]根据本发明的方面，一种微流体装置，适于安装在旋转驱动单元上，其中当安装在旋转驱动单元上并且关于该装置的旋转中心旋转时，在该装置中由于离心力而引起流体流动，该微流体装置包括:样品室，其中样品流体被离心，其中分隔壁被设置在样品室中以与样品室的顶壁和底壁中的至少一个一起形成瓶颈部，以部分地限制样品流体在样品室的径向方向上的流动，其中瓶颈部与顶壁和底壁中的所述至少一个之间的间隙的大小或尺寸大于以样品流体引起毛细现象的间隙的大小或尺寸，并且足够大而在混合工艺期间允许样品流体中的靶细胞和细颗粒通过该间隙向后和向前移动，使得该装置沿着顺时针方向和逆时针方向向后和向前旋转，并且在该装置不旋转时部分地限制样品流体在向内径向方向上的流动。
[0008]分隔壁可以具有其中瓶颈部从样品室的内部到样品室的外部在径向方向上变窄的形状。
[0009]分隔壁可以在样品室的圆周方向上跨过样品室的览度而形成。
[0010]分隔壁可以在样品室的圆周方向上跨过样品室的宽度的一部分而形成。
[0011]该装置可以还包括:多个分隔壁，布置在样品室的圆周方向上，其中分隔壁彼此间隔开，在相邻的分隔壁之间具有开口。
[0012]每个开口可以在径向方向上从样品室的内部到样品室的外部变窄。
[0013]根据本发明的方面，一种使用微流体装置富集靶细胞的方法，该微流体装置由于离心力而引起其中容纳的流体流动，该方法包括:通过在微流体装置的样品室中混合包含革巴细胞的样品与细颗粒而形成包括结合至细颗粒的祀细胞的祀材料，细颗粒特定连接至革巴细胞的表面标志物，所述样品室具有分隔壁，分隔壁与样品室的顶壁和底壁中的至少一个一起形成瓶颈部，其中瓶颈部与顶壁和底壁中的至少一个之间的间隙的大小或尺寸大于引起毛细现象的间隙的大小或尺寸，并且足够大而在混合期间允许靶材料以及靶细胞和细颗粒通过间隙向后和向前移动，并且在混合之后部分地限制流体在向内径向方向上的流动；通过流体供给通道将包括靶材料的流体运送至容纳密度梯度材料的分离室，密度梯度材料具有比靶材料的密度低并且比流体的密度高的密度；以及在旋转微流体装置时，在分离室中由于施加的离心力而基于密度差异从流体分离靶材料，由此富集靶材料。
[0014]分离可以包括:在分离室中由于离心而从流体分离靶材料而密度梯度材料插设在其间；以及通过恢复通道将靶材料恢复到恢复室中。
[0015]形成祀材料可以包括:在细颗粒被引入到样品室中之如，在样品室中由于尚心力而将样品离心成多个层，多个层包括包含靶细胞的靶层和位于靶层之上的上材料层；通过第二通道将上材料层排放到废料室中；通过第一通道将细颗粒引入到样品室中；以及形成革巴材料，在IE材料中IE细胞结合至细颗粒。
[0016]该方法还包括:在排放之后，关闭第二通道。
[0017]形成靶材料还可以包括:将细颗粒与缓冲剂供给至样品室；通过离心使缓冲剂位于靶层之上；打开第二通道以通过第二通道将缓冲剂排放至废料室；以及关闭第二通道。
[0018]在将细颗粒引入到样品室中之前，形成靶材料还可以包括:将溶胞液供给至样品室以溶解样品中的特定细胞。
[0019]靶细胞可以包括循环肿瘤细胞、癌症干细胞或癌细胞。
[0020]根据本发明的方面，一种使用微流体装置富集靶细胞的方法，该微流体装置由于离心力而引起其中容纳的流体流动，该方法包括:在微流体装置的样品室中容纳包括靶细胞的样品和第一密度梯度材料，第一密度梯度材料具有比靶细胞的密度高的密度；离心样品以使包括靶细胞的靶层位于第一密度梯度材料层之上；将靶层从样品室运送至反应室；在反应室中混合靶层与细颗粒以形成靶材料，细颗粒特定结合至靶细胞的表面标志物，在靶材料中细颗粒结合至所述靶细胞，所述反应室具有分隔壁，分隔壁与反应室的顶壁和底壁中的至少一个一起形成瓶颈部，其中瓶颈部与顶壁和底壁中的至少一个之间的间隙的大小或尺寸大于引起毛细现象的间隙的大小或尺寸，并且足够大而在混合期间允许靶材料以及靶细胞和细颗粒通过间隙向后和向前移动，并且在混合之后部分地限制流体在向内径向方向上的流动；通过流体供给通道将包括靶材料的流体运送至容纳第二密度梯度材料的分离室，第二密度梯度材料具有比靶材料的密度低并且比流体的密度高的密度；以及在旋转微流体装置时，在分离室中由于施加的离心力而基于密度差异从流体分离靶材料，由此富集所述靶材料。
[0021]靶细胞可以包括循环肿瘤细胞、癌症干细胞或癌细胞。
[0022]根据本发明的方面，一种微流体装置，适于安装在旋转驱动单元上，其中当安装在旋转驱动单元上并且关于该装置的旋转中心旋转时，在该装置中由于离心力而引起流体流动，该微流体装置包括:样品供给单元，具有容纳样品流体的样品室，样品流体包括流体和靶材料，在靶材料中细颗粒与样品流体中的靶细胞结合；密度梯度分离单元，容纳具有比靶材料低的密度的密度梯度材料，其中密度梯度分离单元相比于样品室沿着径向方向更远离旋转中心；流体供给通道，将样品供给单元与密度梯度分离单元流体性地耦接；以及流体供给阀，在流体供给通道中，以选择性地允许样品流体流过流体供给通道，其中密度梯度分离单元从样品供给单元接收样品流体，基于密度差异而从流体分离靶材料。
[0023]样品室可以包括分隔壁，分隔壁与样品室的顶壁和底壁中的至少一个一起形成瓶颈部以部分地限制样品流体在样品室的径向方向上的流动，其中瓶颈部与顶壁和底壁中的至少一个之间的间隙的大小或尺寸大于引起毛细现象的间隙的大小或尺寸，并且足够大而在混合工艺期间允许样品流体中的靶细胞和细颗粒通过间隙向后和向前移动，使得该装置沿着顺时针方向和逆时针方向向后和向前旋转，并且在该装置不旋转时部分地限制样品流体在向内径向方向上的流动。
[0024]间隙的大小或尺寸可以介于大约0.5mm与大约20.0mm之间。
[0025]分隔壁可以具有其中瓶颈部从样品室的内部到所述样品室的外部在样品室的径向方向上变窄的形状。
[0026]分隔壁可以在样品室的圆周方向上跨过样品室的宽度而形成。
[0027]分隔壁可以在样品室的圆周方向上跨过样品室的宽度的一部分而形成。
[0028]多个分隔壁可以布置在样品室的圆周方向上，其中分隔壁彼此间隔开，在相邻的分隔壁之间具有开口。
[0029]每个开口可以在径向方向上从样品室的内部到样品室的外部变窄。
[0030]密度梯度分离单元可以包括:分离室，通过流体供给通道与样品室耦接并且容纳密度梯度材料，恢复室，通过恢复通道连接至分离室并且恢复来自分离室的靶材料，以及恢复阀，在恢复通道中以选择性地控制流体流过恢复通道。
[0031]该微流体装置可以还包括:废料室；排放通道，设置在分离室上而在径向方向上比恢复通道更靠近旋转中心并且将分离室与废料室流体性地耦接，以允许从分离室排放流体的设置在靶材料之上的部分；以及排放阀，在排放通道中以控制流体流过排放通道。
[0032]样品供给单元可以包括细颗粒室、第一通道以及第一阀，细颗粒室容纳细颗粒，第一通道将样品室与细颗粒室流体性地耦接，第一阀在第一通道中以选择性地允许细颗粒流入到样品室中，以及密度梯度分离单元与样品室流体性地耦接。
[0033]在样品室中样品由于离心力而可以被分离成多个层，以及该多个层可以包括包含靶细胞的靶层和位于靶层之上的上材料层，以及该微流体装置还可以包括:废料室；第二通道，将样品室与废料室流体性地耦接；以及第二阀，用于选择性地打开第二通道，其中上材料层通过第二通道被排放至废料室。
[0034]第三阀还可以设置在第二通道中并且可以比第二阀更靠近废料室，使得当上材料层被排放时，第三阀关闭第二通道。
[0035]第四阀还可以设置在第二通道中以顺序地关闭和打开第二通道。
[0036]该微流体装置可以还包括:溶胞液室，用于提供溶胞液以溶解样品中的特定细胞。
[0037]样品室可以容纳样品和第一密度梯度材料，由于离心力而使包括靶细胞的靶层位于第一密度梯度材料之上，以及样品供给单元还包括从样品室接收包括靶层的流体的反应室，使得流体与细颗粒混合而形成靶材料。
[0038]靶细胞可以包括循环肿瘤细胞、癌症干细胞或者癌细胞。
【专利附图】

【附图说明】
[0039]通过以下结合附图对实施方式的描述，这些和/或其它方面将变得明显并且更易于理解，附图中:
[0040]图1A是根据本发明的实施方式的细胞富集系统的示意图；
[0041]图1B是根据本发明的实施方式的去除了顶板的微流体装置的透视图；
[0042]图1C是进一步包括废料室的图1B的微流体装置的透视图；
[0043]图2A和图2B是根据本发明的实施方式的常闭阀的截面图；
[0044]图3是根据本发明的实施方式的包括微粒室的微流体装置的平面图；
[0045]图4是根据本发明的实施方式的包括废料室的微流体装置的平面图；
[0046]图5示出具有常开阀的第二通道的图示；
[0047]图6A和图6B是根据本发明的实施方式的常开阀的截面图；
[0048]图7示出具有开/闭阀的第二通道的图示；
[0049]图8A、图8B和图8C是根据本发明的实施方式的开/闭阀的截面图；
[0050]图9是根据本发明的实施方式的包括溶胞液室的微流体装置的平面图；
[0051]图10是根据本发明的实施方式的包括反应室的微流体装置的平面图；
[0052]图11是根据本发明的实施方式的包括设置在样品室中的分隔壁的微流体装置的平面图；
[0053]图12是沿图11的线A-A’截取的截面图；
[0054]图13是瓶颈部的示例的截面图；以及
[0055]图14是根据本发明的另一实施方式的包括设置在样品室中的分隔壁的微流体装置的平面图。
【具体实施方式】
[0056]现在将详细参照实施方式，附图中示出了实施方式的示例，其中相同的附图标记始终指代相同的元件。在这点上，本实施方式可以具有不同的形式，而不应被解释为受限于在此阐述的描述。因此，在下文仅参照附图来描述实施方式，从而解释本描述的多个方面。诸如“......中的至少一个”的表述在一列元件之前时,其修饰整列的元件而不是修饰列中的各个元件。
[0057]在下文，参照附图详细描述本发明的实施方式。在此给出这些实施方式仅是为了说明的目的，本发明的范围不限于此。
[0058]图1A示出根据本发明的实施方式的包括微流体装置I的细胞富集系统的示例。图1A示出旋转驱动单元510和电磁波发生器520。旋转驱动单元510旋转微流体装置I以提供用于离心样品和移动流体的离心力。旋转驱动单元510可以使微流体装置I在其阀面向电磁波发生器520的预定位置处停止旋转。电磁波发生器520被用于操作微流体装置I的阀，例如，电磁波发生器520辐照激光束。电磁波发生器520可以在微流体装置I的径向方向移动。虽然在图1中没有示出，但是旋转驱动单元510可以包括电机驱动装置，该电机驱动装置控制微流体装置I的角坐标以将微流体装置I的阀与电磁波发生器520对准。例如，电机驱动装置可以是步进电机或直流电机。附图标记530表示用于控制驱动单元510和电磁波发生器520的操作并且还用于控制富集工艺的操作的控制单元，如下面将参照不同的实施方式描述的。
[0059]图1B是不包括顶板的微流体装置I的透视图。根据本实施方式的微流体装置I引起容纳在其中的流体由于离心力而流动。微流体装置I包括用于提供容纳流体的空间和该流体的通道的微流体结构。微流体装置I例如可以具有可旋转的盘形状，但不限于此。
[0060]微流体装置I可以由可模制并具有生物学惰性表面的塑料材料形成，这种塑料材料的示例为压克力或PDMS。然而，用于微流体装置I的材料不限于此，并可以是具有化学和生物学稳定性、光学透明度和机械加工性的各种材料中的任何一种。微流体装置I可以包括多个板。相应于室或通道的凹入结构形成在板的接触面处，然后，板被结合以在微流体装置I内形成用于容纳流体的空间和用于该流体的通道。例如，根据本发明的实施方式，微流体装置I可以具有包括顶板和底板的双板结构。然而，根据另一实施方式，微流体装置I可以具有包括顶板、底板和限定微流体结构的隔板的三板结构。板可以通过利用粘合剂或双面胶带而结合，或者通过超声波熔融或激光熔融而结合。
[0061]微流体装置I可以具有单个微流体结构或多个微流体结构。例如，微流体装置I可以被分为若干区域，每个区域可以包括独立地操作的微流体结构。例如，根据本实施方式的微流体装置I包括两个区域101和102，每个区域包括微流体结构。区域101和102的微流体结构可以具有实质上相同的结构，因此在下文中仅详细描述区域101的微流体结构。
[0062]微流体装置I可以在其旋转中心RC具有安装部500，用于放置在旋转驱动单元510上。样品供给单元100和密度梯度分离单元200被设置在从旋转中心RC起的径向方向上，即，在离心力方向上。样品供给单元100和密度梯度分离单元200通过流体供给通道10而彼此连接。流体供给阀15被设置到流体供给通道10以控制流体的流动。
[0063]样品供给单元100提供包括祀细胞-细颗粒复合物(target cell-fine beadscomplex)(即，祀材料)的流体。在样品供给单元100中，样品中包含的祀细胞接触细颗粒，细颗粒附着到靶细胞上以形成靶细胞-细颗粒复合物。例如，细颗粒可以是固体细颗粒、磁珠、凝胶珠或聚合物细颗粒等。根据本发明的实施方式，样品供给单元100可以包括用于容纳样品和细颗粒的样品室110。样品室110可以具有用于装载样品的入口 hi。在富集靶细胞之前，细颗粒可以通过入口 hi被装载到样品室110中。图1B所示的入口 hi可以被设置在顶板中。根据本发明的另一实施方式，当微流体装置I为预定任务而制造时，适用于该任务的细颗粒可以在微流体装置I的制造过程中预先容纳在样品室110中。分隔壁400可以被设置到样品室110以至少部分地限制流体在径向方向上的流动。将结合图11至图14描述分隔壁400。
[0064]密度梯度分离单元200被设置为从由样品供给单元100提供的包括靶材料的流体分离靶材料。密度梯度分离单元200可以包括容纳密度梯度材料(DGM)的分离室210。DGM被设置为基于密度梯度而从包括靶材料的流体分离靶材料。DGM的密度可以小于靶材料的密度并且大于靶材料之外的流体的密度。由于密度差异，DGM位于流体与靶材料之间，从而从流体分离靶材料。在分离室210中可以为DGM设置入口 h2。入口 h2可以改为设置在顶板中。当微流体装置I仅为特定任务使用时，适用于该任务的DGM在微流体装置I的制造过程中被预先容纳在分离室210中。
[0065]为了使流体由于离心力而从样品室110流动至分离室210，分离室210在从旋转中心RC起的径向方向上被设置在样品室110的外侧。样品室110和分离室210通过具有流体供给阀15的流体供给通道10而彼此连接。在分离室210中，靶材料被从流体分离，而DGM插置在靶材料与流体之间。靶材料可以聚集在分离室210的最下层，即，从旋转中心RC起的径向方向上的最外侧。提取孔(未示出)可以设置在分离室210中以提取靶材料。提取孔可以设置在分离室210在径向方向上的外部区域中。例如，通过利用吸液管经由提取孔提取最下层中的靶材料，由此从样品分离靶材料。通过这样做，样品中很少量存在的靶细胞可以被有效地分离和富集。
[0066]密度梯度分离单元200可以还包括容纳靶材料的恢复室220。恢复室220在从旋转中心RC起的径向方向上设置在分离室210的外侧。恢复室220通过恢复通道20连接至分离室210。恢复阀25被设置在恢复通道20中。在分离室210中，靶材料聚集在分离室210的最下层中，当恢复通道25通过恢复阀25打开时，靶材料由于离心力而流入到恢复室25中。如这里使用的，“最下层”旨在表示最远离旋转中心RC的材料层，例如，混合物中的最重的材料将在离心期间聚集在最远离RC之处；类似地，“最高层”旨在表示最接近旋转中心RC的材料层，例如，最轻的材料将在离心期间聚集在最接近RC之处。
[0067]参照图1C，在微流体装置I中还可以设置废料室300。分离室210可以通过排放通道30连接至废料室300。排放通道30可以连接至分离室210，使得排放通道30比恢复通道20更靠近旋转中心RC。排放阀35可以被设置在排放通道30中以控制流体的流动。由于这样的结构，分离室210的上层中的材料而不是最下层中的靶材料经由排放通道30被排放到废料室300中，靶材料可以通过恢复通道20被移动到恢复室220中。
[0068]各种微流体阀可以被用作流体供给阀15、恢复阀25和排放阀35。流体供给阀15、恢复阀25和排放阀35是常闭阀，其避免流体的流动，直到其从外部接收能量而打开。图2A和图2B示出常闭阀的示例。常闭阀可以包括阀材料VI，其在室温下为固态，从而阻塞通道C，如图2A所示。阀材料Vl在高温下熔化并且在通道C中移动，如图2B所示，在通道C被打开的同时阀材料Vl返回到固态。从外部辐照的能量可以是例如电磁波，能源可以是辐照激光束的激光束源、辐照可见光或红外光的发光二极管或者氙灯。当使用激光束源时，激光束源可以包括至少一个激光二极管。外部能源可以根据可被阀材料Vl中包含的放热微粒吸收的电磁波的波长来选择。作为阀材料VI，可以使用热塑性树脂，诸如环烯烃共聚物(C0C)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚氧亚甲基(Ρ0Μ)、全氟烷氧烃((PFA)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚醚醚酮(PEEK)、聚酰胺(PA)、聚砜(PSU)或聚偏二氟乙烯(PVDF)。此外，作为阀材料Vl，可以使用在室温下以固态存在的相变材料。相变材料可以是蜡。在被加热时，蜡融化成液态，其体积膨胀。蜡的示例为石蜡、微晶蜡、合成蜡和天然蜡。相变材料可以是凝胶或热塑性树脂。作为凝胶，可以使用聚丙烯酰胺、聚丙烯酸脂、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯酰胺。吸收电磁波能量并且散发热的多个放热微粒可以分散在阀材料Vl中。精细放热微粒可以具有大约Inm至大约100 μ m的平均微粒尺寸，以自由通过具有大约0.1mm的深度和大约Imm的宽度的精细通道C。精细放热微粒可以具有放热性质，因此在通过例如暴露于激光而被供给电磁波能量时，其温度迅速升高，精细放热微粒可以均匀地分散在蜡中。为了获得这种性质，每个精细放热微粒可以具有包括金属性成分的核和疏水表面结构。例如，精细放热微粒可以各自具有其中多个表面活性剂被接合并且覆盖Fe核的分子结构。精细放热微粒可以在载体油中保持分散状态。载体油也可以是疏水的，以允许具有疏水表面结构的精细放热微粒均匀地分散。具有精细放热微粒分散在其中的载体油与熔化的相变材料混合，混合物被装载到通道C中并且被固化以阻塞通道C。精细放热微粒不限于作为精细放热微粒给出的聚合物微粒，量子点或磁珠也可以被用作精细放热微粒。此外，精细放热微粒可以例如是精细金属氧化物，诸如Al203、Ti02、Ta203、Fe203、Fe304 *Hf02。此外，精细放热微粒并非必须包含在常闭阀中，根据本发明的另一实施方式，常闭阀可以是没有任何精细放热微粒的相变材料。
[0069]靶细胞可以是循环肿瘤细胞(CTC)、癌症干细胞或癌细胞。靶细胞可以例如是选自以下构成的组的癌症或肿瘤细胞:膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’ s sarcoma)、平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤、成人T细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤(glioblastoma)/星状细胞瘤(astiOcytoma)、黑素瘤、间皮瘤和肾母细胞瘤(Wilms’ tumor)。
[0070]样品可以是各种生物样品中的任一个，只要靶细胞可以存在于其中即可。例如，生物样品可以选自以下构成的组:活检样品(biopsy sample)、组织样品(tissue sample)、其中分离的细胞悬浮在液体介质中的细胞悬液、细胞培养物及其组合。生物样品可以选自以下构成的组:血液、骨髓、唾液、泪腺液体、尿液、精液、粘液性流体及其组合。例如，血液可以用作分离CTC的样品。
[0071]对靶细胞的表面标志物特定的配位体可以结合到细颗粒。细颗粒可以结合到靶细胞以增加靶细胞的密度。细颗粒可以具有可引起样品中的靶材料的密度与靶细胞之外的其余细胞的密度之间的差异的密度。例如，当包含癌细胞作为靶细胞的血液被用作生物样品时，由于白血球和红血球的密度分别为大约1.07g/cm3和大约1.lg/cm3,因此考虑到这样的密度可以选择具有适当密度的细颗粒。细颗粒可以例如选自以下构成的组:聚苯乙烯微粒、聚甲基丙烯酸甲酯微粒、胶乳(latex)微粒、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)微粒、环烯烃共聚物微粒、三聚氰胺微粒及其复合物，但可以不限于此。细颗粒的直径可以根据待分离的靶细胞和待使用的细颗粒而改变，例如，可以在大约Inm至大约100 μ m或大约IOnm至大约ΙΟμπι的范围内。细颗粒可以是纳米珠或微米珠。
[0072]表面标志物可以选自蛋白质、糖、脂质、核苷酸及其组合物构成的组。例如，表面标志物可以是在癌症或肿瘤细胞中被特定地表达并显示在细胞膜上的蛋白质，例如，可以是EpCAM、c-Met、细胞角蛋白(cytokeratines)、0)45、Her2或其组合。此外，对表面标志物特定的配位体可以是特定地连接到抗原蛋白质的抗体。
[0073]下面，详细描述根据本发明的第一实施例的通过使用图1B和图1C的微流体装置I富集靶细胞的方法。在本实施例中，包含循环肿瘤细胞的血液被用作样品。微流体装置I能够容纳相对大量的血液，例如，大约ImL至大约20mL。这样相对大量的生物样品不能被常规的旋转微流体装置处理，该常规的微流体装置通常为了在临床化学中的应用或利用血浆的免疫分析而设计的，并且容纳相对少量的生物样品，诸如几uL。
[0074]【制备】:包含循环肿瘤细胞作为靶细胞的血液(例如，大约5mmL)和具有特定连接至靶细胞的抗原的抗体的细颗粒(例如，大约IXlO8或更多)经由入口 hi被装载到样品室110中。此外，适当选择的DGM经由入口 h2被装载到分离室210中。DGM可以例如是菲可(Ficoll)、珀可(Percoll)、多糖、NaCl溶液等。白血球和循环肿瘤细胞具有类似的物理性质，因此，当它们基于密度梯度被离心时，白血球和循环肿瘤细胞在同一层中被隔离。因此，根据本实施方式，细颗粒被结合至循环肿瘤细胞，以产生与白血球的密度差异，由此允许仅从血液分离癌细胞。细颗粒可以例如是三聚氰胺微粒，其密度可以例如是大约1.57g/cm3，其大于血液中的生物微粒的密度，即，大约1.05至1.lg/cm3。
[0075]【靶材料(靶细胞-细颗粒复合物)的形成】:微流体装置I被安装在旋转驱动单元510上，然后微流体装置I沿着顺时针方向和逆时针方向向后和向前旋转预定时间段，以搅拌和混合细颗粒与靶细胞并且从而使细颗粒接触靶细胞，由此将细颗粒附接至靶细胞。通过这样做,在样品室Iio中形成靶材料。
[0076]【流体的运送】:通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至流体供给阀15以打开流体供给通道10。因此，阀材料Vl融化，由此打开流体供给通道10。当微流体装置I旋转时，容纳在样品室110中的流体由于离心力而通过流体供给通道10运送到容纳DGM的分离室210。
[0077]【基于分离室210中的密度梯度而分离靶材料】:微流体装置I以例如3000rpm旋转大约5分钟。因此，在分离室210中形成多个层，其根据构成样品的材料的密度梯度而彼此区分。例如，在分离室210中，样品被分成DGM层、红血球层、白血球层以及血浆层。由于靶细胞与细颗粒之间的结合，靶材料的密度是最高的，因此靶细胞可以以细颗粒与其结合的靶材料的形式而从白血球层分离，并且可以位于分离室210的最下层中，即，在径向方向上最远离旋转中心RC，而DGM层、红血球层、白血球层以及血浆层依次更接近旋转中心RC。
[0078]【靶材料的恢复】:微流体装置I停止旋转，然后通过使用例如吸液管经由提取孔(未示出)从分离室210提取靶材料。为了增加恢复靶材料的可靠性，可以使用附加的自动工艺。为此，通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至恢复阀25以打开恢复通道20。当微流体装置I旋转时，位于分离室210的最下层中的靶材料由于离心力而经由恢复通道20运送到恢复室220。在这点上，恢复阀25可以是如图8A和图SB所示的打开或关闭的阀。当靶材料被完全运送时，微流体装置I停止旋转，激光束被辐照至恢复阀25以关闭恢复通道20。
[0079]当使用图1C的微流体装置I时，位于靶材料之上的流体可以被首先排放以减少异质材料的流入和改善富集率。例如，通过使用电磁波发生器520可以将电磁波(例如，激光束)辐照至排放阀35。由于辐照，阀材料Vl可以熔化，因此排放通道30打开。当微流体装置I旋转时，容纳在分离室210中的除了靶材料之外的剩余流体可以由于离心力而经由排放通道30运送到废料室300。微流体装置I停止旋转，通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至恢复阀25以打开恢复通道20。然后，当微流体装置I旋转时，靶材料由于离心力而经由恢复通道20流入恢复室220。
[0080]靶材料可以经由设置在恢复室220中的提取孔(未示出)而被提取。通过这样做，血液中的靶细胞可以通过从血液分离而被富集。
[0081]靶材料的密度和尺寸可以相比于血液中的其它细胞的密度和尺寸增加，因此通过过滤可以容易地分离靶材料。从而，后续过滤可以使富集的靶材料从流体分离。
[0082]图3是根据本发明的实施方式的微流体装置I的平面图。根据本实施方式的微流体装置I与图1B所示的微流体装置I的不同之处在于样品和细颗粒被分别容纳。参照图3，样品供给单元100包括样品室110和微粒室120。样品室110容纳样品。样品室110可以包括分隔壁400以部分地限制流体在径向方向上的流动，其将结合图11至图14而进行描述。微粒室120容纳细颗粒。微粒室120可以比样品室110在径向方向上更靠近旋转中心RC。微粒室120可以通过第一通道40连接至样品室110。第一通道40可以包括第一阀45以控制流体的流动。第一阀45是图2A和图2B所示的闭阀，并且接收电磁能量来打开第一通道40。细颗粒可以与传送流体、即缓冲剂一起容纳在微粒室120中，以使得细颗粒通过第一通道40被容易地供给至样品室110。微粒室120可以连接至第一区域101和第二区域102的每个的样品室110。
[0083]在下文，将描述根据本发明的第二实施方式的通过使用图3所示的微流体装置I富集靶细胞的方法。在本实施方式中，使用包含循环肿瘤细胞的血液作为样品。
[0084]【制备】:包含循环肿瘤细胞作为靶细胞的血液通过入口hi装载到样品室110中。此外，适当选择的DGM 通过入口 h2装载到分离室210中。此外，具有特定地连接至靶细胞的抗原的抗体的细颗粒与缓冲剂一起通过入口 h3装载到微粒室120中。
[0085]【细颗粒的运送】:微流体装置I被安装在旋转驱动单元510上，通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至第一阀45来打开流体第一通道40。微流体装置I旋转以由于离心力而将细颗粒与缓冲剂一起从微粒室120运送至样品室110。
[0086]然后，执行【流体的运送】、【基于分离室210中的密度梯度而分离靶材料】以及【靶材料的恢复】以通过从血液分离而富集靶细胞。此外，过滤作为后续工艺而被执行以获得从流体分离的富集的靶材料。
[0087]细颗粒和靶细胞的特定结合可以取决于上述抗原-抗体结合。样品可能包含各种蛋白质，这些蛋白质可能抑制细颗粒与靶细胞之间的特定结合。例如，当具有类似于抗原的结构的蛋白质被预先结合至靶细胞的表面标志物时，可能阻止细颗粒与靶细胞之间的结合。此外，当具有类似于抗体的结构的蛋白质被结合至细颗粒的配位体时，可能阻止细颗粒与靶细胞之间的结合。这样，样品中的蛋白质阻止靶细胞-细颗粒复合物的产生，由此降低了靶细胞的富集效率。为了防止富集效率的降低，在将细颗粒与样品混合之前，可以将样品中的蛋白质从样品去除。
[0088]图4是根据本发明的实施方式的微流体装置I的平面图。根据本实施方式的微流体装置I与图3所示的微流体装置I的不同之处在于，当容纳在样品室110中的样品被离心之后，位于包含靶细胞的靶层之上的上材料层被去除。样品室110可以包括分隔壁400以部分地限制流体在径向方向上的流动，其将结合图11至图14进行描述。图4示出了废料室300。废料室300通过第二通道50连接至样品室110。废料室300设置在样品室110在从旋转中心RC起的径向方向上的外侧。在本实施方式中，废料室300连接至分离室210和样品室110。然而，根据本发明的另一实施方式，分离室210和样品室110可以连接至两个不同的废料室。第二通道50和样品室110的连接位置可以根据样品的上材料层的量而改变。例如，当血液被用作样品时，血浆可以从血液去除。在这一点上，血液的成分比可以根据病人而改变，因此血浆的量也会改变。根据本实施方式的第二通道50可以包括两个连接通道51和52。连接通道51和52可以在从旋转中心RC起的径向方向上在不同位置连接至样品室110。连接通道51和51各自包括第二阀55。第二阀55可以是图2A和图2B所示的常闭阀，并且可以接收电磁能量来打开连接通道51和52。根据待去除的上材料层的量，可以打开连接通道51和52中的一个。当上材料层的量相对少时，比连接通道52更靠近旋转中心RC的连接通道51打开，而当上材料层的量相对大时，比连接通道51更远离旋转中心RC的连接通道52打开。连接通道的数目可以是三个或更多。
[0089]在下文，将描述根据本发明的第三实施方式的通过使用图4所示的微流体装置I富集靶细胞的方法。在本实施方式中，包含循环肿瘤细胞的血液被用作样品。
[0090]【制备】:包含循环肿瘤细胞作为靶细胞的血液被装载到样品室110中。此外，具有特定地连接至祀细胞的抗原的抗体的细颗粒与缓冲剂一起被装载到微粒室120中。此外，适当选择的DGM被装载到分离室210中。如上所述，DGM可以被预先装载到分离室210中。由于第一通道40通过第一阀45关闭，因此细颗粒与样品分离。
[0091]【样品的离心】:微流体装置I被安装在旋转驱动单元510上，然后以大约1000至8000rpm (例如，大约3000rpm)的旋转速率旋转大约5分钟，通过这样做，样品室110中的血液可以基于密度差异而被分成多个层。包含最重的红血球的红血球层在径向方向上最远离旋转中心RC。于是，包括白血球和靶细胞的靶层和血浆层(其为上材料层)则依次更靠近旋转中心RC。由于 血液中的蛋白质比血球轻，因此蛋白质位于血浆层中。
[0092]【血浆的排放】:微流体装置I停止旋转，通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至根据血浆的量确定的连接通道51和52中的一个的第二阀55来打开第二通道50。在血浆的排放期间，红血球不应被排放到废料室300。例如，连接通道51和52中的哪一个被打开可以基于样品室110中的样品的最初体积来确定。备选地，在样品的离心之后，可以测量样品的吸收率。基于测量，可以确定样品室110中的血浆层的位置，并且可以打开连接通道51和52中的一个来将血浆排放到废料室300。然后，当微流体装置I旋转时，血浆由于离心力而通过第二通道50被排放至废料室300。在此过程中，阻止靶细胞和细颗粒之间结合的血液蛋白质的全部或至少一部分可以与血浆一起被排放至废料室300。
[0093]【细颗粒的运送】:当血浆的排放完成时，微流体装置I停止旋转，通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至第一阀45来打开第一通道40。当微流体装置I旋转时，细颗粒可以由于离心力而与缓冲剂一起从微粒室120被运送至样品室110。
[0094]【靶材料(靶细胞-细颗粒复合物)的形成】:微流体装置I沿着顺时针方向和逆时针方向旋转预定时间段，以使细颗粒接触靶细胞，由此将细颗粒附接至靶细胞。通过这样做，在样品室Iio中形成靶细胞-细颗粒复合物，即，靶材料。由于血液蛋白质与血浆一起被排放至废料室300，因此可以提高细颗粒与靶细胞之间的结合效率。
[0095]然后，执行根据第一实施方式的【流体的运送】、【基于分离室210中的密度梯度而分离靶材料】以及【靶材料的恢复】以通过从血液分离而富集靶细胞。此外，过滤作为后续工艺而被执行以获得从流体分离的富集的靶材料。
[0096]在细颗粒与缓冲剂一起被传送至样品室110之后，微流体装置I沿着顺时针/逆时针方向旋转以将细颗粒与样品混合。在这一点上，样品室110中流体的水平升高至靶细胞与流体一起经由打开的第二通道50溢出至废料室300的程度。为了避免这种泄漏，如图5所示，第二通道50可以进一步包括第三阀56。第三阀56可以设置为比第二阀55更靠近废料室300。第三阀56是常开阀，并且仅在第三阀56接收能量时，第三阀56关闭通道，并且在此之前，第三阀56打开通道以允许流体流动。
[0097]图6A和图6B是常开阀的示例的截面图。常开阀包括通道C、从通道C沿通道C的宽度方向延伸的阀腔VC以及填充阀腔VC的阀材料Vl。如图6A所示，在外部能量被供给至阀材料Vl之前，由于阀材料Vl存在于阀腔VC中，因此通道C保持打开。然而，当外部能量被供给至阀材料Vl时，阀材料Vl熔化并且膨胀，由此流入通道C中并且在其中固化，由此阻挡流体通过通道C流动。
[0098]在下文，将描述根据本发明的第四实施方式的通过使用图5所示的微流体装置I富集靶细胞的方法。在本实施方式中，包含循环肿瘤细胞的血液被用作样品。
[0099]执行根据第三实施方式的富集靶细胞的方法的【制备】、【样品的离心】以及【血浆的排放】。
[0100]【第二通道50的关闭】
[0101]通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至第三阀56。由于辐照，如图6B所示，阀材料Vl熔化并且固化，由此关闭第二通道50。
[0102]然后，执行根据第三实施方式的【细颗粒的运送】、【靶材料(靶细胞-细颗粒复合物)的形成】、【流体的运送】、【基于密度梯度在分离室210中分离靶材料】以及【靶材料恢复】以通过从血液分离而富集靶细胞。
[0103]此外，过滤作为后续工艺而被执行，以获得从流体分离的富集的靶材料。由于第二通道50关闭，因此在执行【靶材料(靶细胞-细颗粒复合物)的形成】的工艺时，可以防止包含靶细胞的流体从样品室110通过第二通道50泄漏到废料室300。
[0104]如上所述，由于缓冲剂与细颗粒一起被运送至样品室110，因此样品室110中的流体的水平增加。为了在【靶材料(靶细胞-细颗粒复合物)的形成】的工艺中增加细颗粒与靶细胞之间的接触可能性，样品室110中流体的量较少是更佳的。因此，可以去除与细颗粒一起被供给至样品室110的缓冲剂。当在样品室110中执行离心时，缓冲剂存在于上材料层中。因此，在分离血浆之后，可以进一步执行第二离心，以通过第二通道50将缓冲剂排放至废料室300。在去除血浆期间，第二通道50处于打开状态。因此，在第二离心期间，第二通道50保持在关闭状态，并且在第二离心之后，第二通道50打开以通过第二通道50将缓冲剂排放至废料室300。
[0105]为此，如图7所示，第二通道50可以还包括第四阀57。第四阀57是开/关阀，SP，能够依次切换至打开状态/关闭状态/再打开状态的阀。尽管图7所示的第四阀57比第三阀56更远离废料室300，但是第三阀56可以改为比第四阀57更远离废料室300。[0106]图8A至图8C是开/关阀的示例的截面图。参照图8A,开/关阀包括通道C、位于比通道C高的水平的阀腔VC、填充阀腔VC的阀材料Vl以及台阶VS，台阶VS在通道C中在阀腔VC下面部分地交叠阀腔VC并且朝向阀腔VC突出。如图8A所示，在外部能量被供给至阀材料Vl之前，因为阀材料Vl存在于阀腔VC中，所以通道C保持打开。当外部能量被供给至阀材料Vl时，阀材料Vl熔化并且膨胀，由此流到台阶VS上，然后，阀材料Vl固化，由此阻挡流体通过通道C流动，如图SB所示。当更强的外部能量被供给至固化的阀材料Vl时，位于台阶VS上的阀材料Vl熔化并且变为流体。因此，阀材料Vl从台阶VS流入通道C中。结果，如图SC所示，通道C再打开。参照图8A和图SB，阀作为常开阀操作。因此，代替图6A和图6B所示的常开阀，可以使用图8A和图8B所示的阀。此外，参见图8B和图8C，阀作为常闭阀操作。因此，代替图2A和图2B所示的常闭阀，可以使用图SB和图SC所示的阀。
[0107]在下文，将描述根据本发明的第五实施方式的通过使用图7所示的微流体装置I富集阀细胞的方法。在本实施方式中，包含循环肿瘤细胞的血液被用作样品。
[0108]执行根据第三实施方式的富集靶细胞的方法的【制备】、【样品的离心】以及【血浆的排放】。
[0109]【缓冲剂的去除】
[0110]在排放血浆之后，通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至第四阀57来关闭第二通道50，如图8B所示。在此状态下，微流体装置I旋转以执行离心。由于离心，具有最低密度的缓冲剂形成上材料层。然后，电磁波发生器520被用于辐照电磁波(例如，激光束)至第四阀57来打开第二通道50，如图SC所示。然后，微流体装置I旋转，由于离心力，样品室110中包含的缓冲剂经由第二通道50被排放至废料室300。
[0111]然后，如根据靶细胞的富集方法的第四实施方式所述，执行【第二通道50的关闭】。然后，执行 根据第三实施方式的【靶材料(靶细胞-细颗粒复合物)的形成】、【流体的运送】、【基于密度梯度在分离室210中分离靶材料】以及【靶材料恢复】以通过从血液分离而富集靶细胞。此外，过滤作为后续工艺而被执行，以获得从流体分离的富集的靶材料。
[0112]当样品中包含相对大的细胞时，在靶细胞-细颗粒复合物的形成期间细颗粒与靶细胞之间的接触可能性会降低。因此，溶解样品中的特定细胞的溶胞液(lysis solution)被添加以去除相对大的细胞，由此提高细颗粒与靶细胞之间的接触可能性。例如，在血液的情况下，在构成血液的细胞当中，红血球具有最大的尺寸。为了增加样品室110中细颗粒与靶细胞之间的接触可能性，可以去除血液中的红血球。例如，溶解红血球(RBC)的RBC溶胞液被添加至样品室110中。当暴露于RBC溶胞液的时间长时，白血球和癌细胞可能丧失其活性。然而，由于RBC不具有血浆膜，因此RBC相对快速地溶解。例如，当暴露于RBC溶胞液大约10分钟时，RBC溶解，而白血球和癌细胞不溶解。
[0113]图9是根据本发明的实施方式的微流体装置I的平面图。参照图9，溶胞液室130可以进一步设置于微流体装置I。溶胞液室130可以在径向方向上比样品室110更靠近旋转中心RC，以允许溶胞液由于离心力被供给至样品室110。溶胞液室130通过第三通道60连接至样品室110。第三通道60可以包括第五阀65来控制流体的流动。第五阀65是如图2A和图2B所示的常闭阀。虽然图9仅示出设置于第二通道50的第二阀55，但是也可以如图5和图7所示设置第三阀56和第四阀57。样品室110可以包括分隔壁400以部分地限制流体在径向方向上的流动，其将结合图11至图14进行描述。
[0114]在下文，将描述根据本发明的第六实施方式的通过使用图9所示的微流体装置I富集靶细胞的方法。
[0115]【制备】:靶细胞的富集方法的第二至第五实施方式可以被应用于靶细胞的富集方法的第六实施方式。除了靶细胞的富集方法的第二实施方式的【制备】，溶胞液可以被装载至溶胞液室130中。
[0116]【溶胞液的运送】:微流体装置I被安装在旋转驱动单元510上，通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至第五阀65来打开第三通道60。然后，微流体装置I旋转以由于离心力而将溶胞液装载到样品室110中。当溶胞液的装载完成时，微流体装置I沿着顺时针方向/逆时针方向旋转以将样品和溶胞液混合，然后将所得的混合物保持预定时间段，以溶解样品中的巨细胞，例如，血液中的RBC。
[0117]在执行【溶胞液的运送】的过程之后，如靶细胞的富集方法的第二至第五实施方式中所述，执行【样品的离心】、【血浆的排放】、【细颗粒的运送】、【缓冲剂的去除】、【第二通道的关闭】、【靶材料(靶细胞-细颗粒复合物)的形成】、【流体的运送】、【基于密度梯度在分离室210中分离靶材料】以及【靶材料恢复】以通过从血液分离而富集靶细胞。此外，过滤作为后续工艺而被执行，以获得从流体分离的富集的靶材料。
[0118]在前述实施方式中，分离室210设置在样品室110的外侧，样品室110中的流体几乎全部供给至分离室210。然而，本发明的实施方式不限于此。例如，具有比靶细胞高的密度的第一 DGM可以被添加至样品室110，使得包含靶细胞的靶层或者靶层和上材料层位于第一 DGM上，并且从样品室110提取靶层。第一 DGM可以是例如菲可或珀可等。然后，细颗粒被添加至所提取的流体以形成靶细胞-细颗粒复合物，即，靶材料，包括靶材料的流体被运送至分离室210以基于密度差异分离靶材料。
[0119]图10是根据本发明的实施方式的微流体装置的视图。根据本实施方式，仅将样品室Iio中包括靶材料的流体的一部分提供至分离室210。参照图10，样品供给单元100包括样品室110和反应室140。样品室110容纳第一 DGM和样品。在微流体装置I的制造过程中，微流体装置I的样品室110可以已经容纳第一 DGM。此外，第一 DGM可以通过入口 hi被装载到样品室110中以富集靶细胞。样品可以通过入口 hi被装载到样品室110中。第一 DGM具有比样品中包含的靶细胞高的密度。因此，在离心期间，包含靶细胞的流体位于第一 DGM之上，即，比第一 DGM更靠近旋转中心RC。例如，当样品是血液时，第一 DGM可以是具有比RBC小的密度且具有比靶细胞高的密度的材料。通过这样做，包括靶细胞和白血球的靶层和血浆层可以位于第一 DGM之上。样品室110可以包括分隔壁400，以部分地限制流体在径向方向上的流动，其将结合图11至图14进行描述。
[0120]在反应室140中，靶细胞与细颗粒结合以形成靶细胞-细颗粒复合物，即，靶材料。反应室140通过运送通道70连接至样品室110。运送通道70以使得运送通道70位于邻近第一 DGM层的顶表面的方式连接至样品室110。例如，运送通道70到样品室110的连接位置可以基于样品室110中的第一 DGM的最初体积和样品的最初体积来确定。运送阀75被设置于运送通道70中来控制流体的流动。运送阀75是如图2A和2B所示的常闭阀。反应室140可以容纳细颗粒。此外，如图10的虚线所示，细颗粒可以被容纳在微粒室120中，微粒室120通过设置有第一阀45的第一通道40连接至反应室140。[0121]密度梯度分离单元200的结构与如图1B、图3、图4和图9所示的结构相同。分离室210中容纳的DGM可以与第一 DGM相同或不同。例如，当第一 DGM的密度小于靶材料的密度时，第一 DGM和DGM可以彼此相同。
[0122]废料室300可以容纳从样品室110排放的上材料层的一部分，例如，在血液的情况下为血浆。此外，废料室300可以容纳包括从反应室140排放的DGM的流体。
[0123]在下文，将描述根据本发明的第七实施方式的通过使用图10所示的微流体装置I富集靶细胞的方法。在本实施方式中，包含循环肿瘤细胞的血液被用作样品。
[0124]【制备】:包含循环肿瘤细胞作为靶细胞的血液和第一DGM被装载到样品室110中。此外，具有特定地连接至靶细胞的抗原的抗体的细颗粒与缓冲剂一起被装载到微粒室120或反应室140中。此外，适当选择的DGM被装载到分离室210中。
[0125]【样品的离心】:微流体装置I被安装在旋转驱动单元510上，然后以大约2300rpm的旋转速率旋转大约8分钟。结果，在样品室110中，包括最重的RBC的RBC层由于血液中的密度差异而位于径向方向上的最外侧。然后，第一 DGM层、包括白血球和靶细胞的靶层以及包括血浆层的上材料层依次更靠近旋转中心RC。
[0126]如果需要，可以执行【血浆的排放】和【缓冲剂的去除】的过程。
[0127]【靶细胞的运送】:通过使用电磁波发生器520将电磁波(例如，激光束)辐照至运送阀75来打开运送通道70。然后，微流体装置I旋转以由于离心力将包括位于第一 DGM层之上的靶细胞的流体运送至反应室140。
[0128]当细颗粒被容纳在微粒室120中时，可以执行【细颗粒的运送】的过程。
[0129]【靶材料( 靶细胞-细颗粒复合物)的形成】:微流体装置I沿着顺时针方向和逆时针方向旋转预定时间段，以使细颗粒接触靶细胞，由此将细颗粒附接至靶细胞。通过这样做，在反应室140中形成靶细胞-细颗粒复合物，即，靶材料。
[0130]然后，执行【流体的运送】、【在分离室210中基于密度梯度分离靶材料】以及【靶材料的恢复】，以通过从血液分离而富集靶细胞。此外，过滤作为后续工艺而被执行以获得从血液分离的富集的靶材料。
[0131]关于微流体装置1，在容纳在样品室110中的样品通过离心而基于密度梯度分成多个层之后，为了运送靶层或者为了将设置在靶层之上的上材料层排放至废料室300，微流体装置I停止旋转，然后打开阀。由于在此工艺中微流体装置I不旋转，因此离心力没有被施加至容纳在样品室110中的样品，在一段时间过去之后，在样品中多个层可以由于分子运动而缓慢地混合。在此情况下，靶细胞与上材料层混合，这会降低细胞的富集效率，或者靶细胞与上材料层混合而被排放至废料室300。这些缺点可能在缓冲剂被去除时产生。此外，当包括靶细胞的靶层被运送至图10所示的微流体装置I的反应室140时，需要微流体装置I的停止和运送阀75的打开，在此过程中，样品室110中的靶层可与其他层混合，因此较少量的靶细胞可被运送至反应室140。因此，样品中靶层不需要的材料可能与靶层混合。
[0132]参照图1B、图3、图4、图9和图10，样品室110包括分隔壁400，以防止在离心之后多个层混合。结合图11描述分隔壁400的具体结构。
[0133]图11是根据本发明的实施方式的微流体装置I的平面图。图12是沿着图11的线A-A’截取的截面图。在微流体装置I中，样品室110中的流体在径向方向上的运动被部分地限制。参照图11和图12，样品室110包括分隔壁400以部分地限制样品在径向方向上的流动。例如，如图12所示，分隔壁400可以从样品室110的底壁1002延伸至样品室110的顶壁1001。如图11所示，分隔壁400可以在样品室110的圆周方向上占据样品室110的宽度的一部分。然而，如图11的虚线所示，分隔壁400可以在样品室的圆周方向上占据样品室110的整个宽度。由于分隔壁400，样品室110被成分内部区域111和外部区域112，内部区域111在径向方向上相对靠近旋转中心RC，外部区域112在径向方向上相对远离旋转中心RC。分隔壁400和顶壁1001可以形成其之间的瓶颈部401。瓶颈部401可以将内部区域111连接至外部区域112。虽然在图11中没有示出，但是分隔壁400可以从样品室110的顶壁1001延伸至样品室110的底壁1002以在顶壁1001与底壁1002之间形成瓶颈部 401。
[0134]在样品的离心期间，由于离心力而使样品从内部区域111穿过瓶颈部401流动到外部区域112，以在样品室110中基于密度梯度形成多个层。当微流体装置I停止旋转时，离心力因此消失，瓶颈部401可以限制样品在内部区域111与外部区域112之间的运动。即，流体在样品室110中在径向方向上的流动受到分隔壁400限制，从而将减少或防止通过离心彼此分离的层的混合。瓶颈部401的内部间隙Gl和外部间隙G2，S卩，瓶颈部401与顶壁1001之间的间隙，应该具有大于会引起毛细现象的间隙的大小或尺寸的大小或尺寸，以使得在期望时流体能够通过瓶颈部401流动。流体样品应该能够在离心期间从内部区域111到外部区域112沿着径向方向流动，并且在搅拌期间在内部区域111与外部区域112之间向后和向前流动，以允许混合细颗粒与靶细胞。如果在瓶颈部401中发生毛细现象，则瓶颈部401会被阻挡或阻塞，由此使得在离心和搅拌期间流体难以流动。根据本实施方式，瓶颈部401的内部间隙Gl和外部间隙G2具有大于会引起毛细现象的间隙的大小或尺寸的大小或尺寸，在离心期间，由于离心力而使流体顺利地从内部区域111移动至外部区域112。在离心之后，流体在内部区域111与外部区域112之间的流动可以由于相对窄的内部间隙Gl和外部间隙G2而受到部分地限制。在混合和搅拌期间，微流体装置I沿着顺时针方向和逆时针方向旋转预定的时间长度。样品室110中的细颗粒和靶细胞通过在内部区域111与外部区域112之间向后和向前移动而混合。细颗粒到靶细胞的附着可发生在样品室110的内部区域111和外部区域112 二者中。间隙G2应该允许具有附着的细颗粒的靶细胞(大约50 μ m或更小)、白血球、红血球、靶细胞群(大约300 μ m或更小)等流动。例如，间隙G2的大小可以在0.5mm至20mm的范围内(更优选的，为了更佳的性能，Imm至20mm)。如果间隙太小，颗粒的混合可能不是可能的，或者可能减少混合的效率。
[0135]在离心期间，样品需要从内部区域111顺利地流动至外部区域112。为此，如图12所示，分隔壁400可以以使得瓶颈部401从样品室110的内部到样品室110的外部变窄的方式形成。即，通过瓶颈部401形成的流体通道可以具有内部间隙Gl和窄于内部间隙Gl的外部间隙G2。在离心期间，由于离心力而使样品从内部区域111流动至外部区域112，即，样品可以从较宽的内部间隙Gl到较窄的外部间隙G2而穿过瓶颈部401，以到达外部区域112。然而，在停止离心时，离心力消失。从而，由于窄的外部间隙G2而使样品没有顺利地返回穿过瓶颈部401。因此，在离心期间，样品可以相对顺利地从内部区域111流动至外部区域112，当停止离心时，样品从外部区域112到内部区域111的流动被减少或受到限制。用于形成瓶颈部401的分隔壁400的截面形状可以是具有顶点404的三角形，如图12所示。在这点上，外部区域112的斜边406的倾斜角A2大于内部区域111的斜边405的倾斜角Al。这种结构可以容易地限制样品从外部区域112到内部区域111的流动。此外，由于内部区域111的斜边405和底表面113在其之间不具有台阶，因此在离心期间样品可以从内部区域111顺利地流动到外部区域112。用于形成瓶颈部401的分隔壁400的截面形状可以采取其它形状，包括曲面形状。
[0136]虽然图12所示的分隔壁400具有三角形截面，但是本发明的实施方式不限于此。如图13所示，分隔壁400的截面可以是具有斜边405和406以及平行于顶壁1001的顶面407的梯形。此外，分隔壁400的截面可以具有各种其他形状，只要瓶颈部401的最小间隙的大小或尺寸大于会引起毛细现象的间隙的大小或尺寸即可。
[0137]例如，当在样品室110中离心包含循环肿瘤细胞的血液时，血浆层、白血球和循环肿瘤细胞层以及RBC层依次位于从样品室110的内部到外部的方向上。分隔壁400可以位于血浆层与白血球和循环肿瘤细胞层之间。即，分隔壁400可以以使得血浆层位于内部区域111中并且白血球和循环肿瘤细胞层以及RBC层位于外部区域112中的方式分隔样品室110。根据本发明的另一实施方式，分隔壁400可以以使得分隔壁410的外部区域112的斜边406位于血浆层与白血球和循环肿瘤细胞层之间的方式分隔样品室110。通过这样做，在离心之后包含抑制循环肿瘤细胞与细颗粒之间结合的蛋白质的血浆层与包含循环肿瘤细胞的层的混合可能性可以降低。
[0138]图14是根据本发明的实施方式的微流体装置I的平面图。参照图14，在样品室110的圆周方向上多个分隔壁410彼此间隔开，以在分隔壁410之间形成至少一个开口420。开口 420的宽度可以例如在大约200μπι至Icm的范围内。分隔壁410可以具有相同的长度，并且至少一个分隔壁410可以具有与其他分隔壁410不同的长度。例如，分隔壁410可以从底壁1002延伸到顶壁1001。由于分隔壁410，样品室110被分成内部区域111和外部区域112，内部区域111在径向方向上相对靠近旋转中心RC，外部区域112在径向方向上相对远离旋转中心RC。开口 420可以将内部区域111连接至外部区域112。
[0139]如图14所示，开口 420可以从样品室110的内部到外部变窄。由于这种结构而使样品可以相对顺利地从内部区域111流动至外部区域112，样品在其相反方向的流动被减少或受到限制。此外，至少一个分隔壁410可以与顶壁1001 —起形成瓶颈部401，如图12和图13所示。虽然在图14中没有示出，但是分隔壁410可以从样品室110的顶壁1001延伸至底壁1002。分隔壁410和开口 420也可以应用于图1Β、图3、图4、图9和图10的微流体装置I。
[0140]应该理解，在此描述的示例性实施方式应该仅以说明的意义而不是出于限制的目的考虑。每个实施方式中的特征或方面的描述应该通常认为可用于其他实施方式中的其他类似特征或方面。
[0141]本申请要求于2012年11月28日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请N0.10-2012-0136552的优先权，其公开通过引用整体结合于此。
【权利要求】
1.一种微流体装置，适于安装在旋转驱动单元上，其中当安装在所述旋转驱动单元上并且关于所述装置的旋转中心旋转时，在所述装置中由于离心力而引起流体流动，所述微流体装置包括: 样品室，其中样品流体被离心， 其中分隔壁被设置在所述样品室中以与所述样品室的顶壁和底壁中的至少一个一起形成瓶颈部，以部分地限制所述样品流体在所述样品室的径向方向上的流动，以及 其中所述瓶颈部与所述顶壁和所述底壁中的所述至少一个之间的间隙的大小或尺寸大于以所述样品流体引起毛细现象的间隙的大小或尺寸，并且足够大而在混合工艺期间允许所述样品流体中的靶细胞和细颗粒通过所述间隙向后和向前移动，使得所述装置沿着顺时针方向和逆时针方向向后和向前旋转，并且在所述装置不旋转时部分地限制所述样品流体在向内的径向方向上的流动。
2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中 所述分隔壁具有其中所述瓶颈部从所述样品室的内部到所述样品室的外部在径向方向上变窄的形状。
3.根据权利要求2所述的微流体装置，其中 所述分隔壁在所述样品室的圆周方向上跨过所述样品室的宽度而形成。
4.根据权利要求2所述的微流体装置，其中 所述分隔壁在所述样品室的圆周方向上跨过所述样品室的宽度的一部分而形成。
5.根据权利要求2所述的微流体装置，还包括:· 多个所述分隔壁，布置在所述样品室的圆周方向上，其中所述分隔壁彼此间隔开，在相邻的分隔壁之间具有开口。
6.根据权利要求5所述的微流体装置，其中 每个所述开口在所述径向上从所述样品室的内部到所述样品室的外部变窄。
7.一种使用微流体装置富集靶细胞的方法，所述微流体装置由于离心力而引起其中容纳的流体流动，所述方法包括: 通过在所述微流体装置的样品室中混合包含靶细胞的样品与细颗粒而形成包括结合至所述细颗粒的所述靶细胞的靶材料，所述细颗粒特定连接至所述靶细胞的表面标志物，所述样品室具有分隔壁，所述分隔壁与所述样品室的顶壁和底壁中的至少一个一起形成瓶颈部，其中所述瓶颈部与所述顶壁和所述底壁中的所述至少一个之间的间隙的大小或尺寸大于引起毛细现象的间隙的大小或尺寸，并且足够大而在混合期间允许所述靶材料以及靶细胞和细颗粒通过所述间隙向后和向前移动，并且在混合之后部分地限制流体在向内的径向方向上的流动； 通过流体供给通道将包括所述靶材料的流体运送至容纳密度梯度材料的分离室，所述密度梯度材料具有比所述靶材料的密度低并且比所述流体的密度高的密度；以及 在旋转所述微流体装置时，在所述分离室中由于施加的离心力而基于密度差异从所述流体分离所述靶材料，由此富集所述靶材料。
8.根据权利要求7所述的方法，其中 分尚包括: 在所述分离室中由于离心而从所述流体分离所述靶材料而所述密度梯度材料插设在其间；以及 通过恢复通道将所述靶材料恢复到恢复室中。
9.根据权利要求7所述的方法，其中 形成所述祀材料包括: 在所述细颗粒被引入到所述样品室中之前，在所述样品室中由于离心力而将所述样品离心成多个层，所述多个层包括包含所述靶细胞的靶层和位于所述靶层之上的上材料层；通过第二通道将所述上材料层排放到废料室中； 通过第一通道将所述细颗粒引入到所述样品室中；以及 形成所述靶材料，在所述靶材料中所述靶细胞结合至所述细颗粒。
10.根据权利要求9所述的方法，其中 在排放之后，所述方法还包括:关闭所述第二通道。
11.根据权利要求10所述的方法，其中 形成所述靶材料还包括: 将所述细颗粒与缓冲剂供给至所述样品室； 通过离心使所述缓冲剂位于所述靶层之上； 打开所述第二通道以通过所述第二通道将所述缓冲剂排放至所述废料室；以及 关闭所述第二通道。
12.根据权利要求7所述的方法，其中` 在将所述细颗粒引入到所述样品室中之前，形成所述靶材料还包括:将溶胞液供给至所述样品室以溶解所述样品中的特定细胞。
13.根据权利要求7所述的方法，其中 所述靶细胞包括循环肿瘤细胞、癌症干细胞或癌细胞。
14.一种使用微流体装置富集靶细胞的方法，所述微流体装置由于离心力而引起其中容纳的流体流动，所述方法包括: 在所述微流体装置的样品室中容纳包括靶细胞的样品和第一密度梯度材料，所述第一密度梯度材料具有比所述靶细胞的密度高的密度； 离心所述样品以使包括所述靶细胞的靶层位于所述第一密度梯度材料层之上； 将所述靶层从所述样品室运送至反应室； 在反应室中混合所述靶层与细颗粒以形成靶材料，所述细颗粒特定结合至所述靶细胞的表面标志物，在所述靶材料中所述细颗粒结合至所述靶细胞，所述反应室具有分隔壁，所述分隔壁与所述反应室的顶壁和底壁中的至少一个一起形成瓶颈部，其中所述瓶颈部与所述顶壁和所述底壁中的所述至少一个之间的间隙的大小或尺寸大于引起毛细现象的间隙的大小或尺寸，并且足够大而在混合期间允许所述靶材料以及靶细胞和细颗粒通过所述间隙向后和向前移动，并且在混合之后部分地限制流体在向内的径向方向上的流动； 通过流体供给通道将包括所述靶材料的流体运送至容纳第二密度梯度材料的分离室，所述第二密度梯度材料具有比所述靶材料的密度低并且比所述流体的密度高的密度；以及在旋转所述微流体装置时，在所述分离室中由于施加的离心力而基于密度差异从所述流体分离所述靶材料，由此富集所述靶材料。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述靶细胞包括循环肿瘤细胞、癌症干细胞或癌细胞。
16.一种微流体装置，适于安装在旋转驱动单元上，其中当安装在所述旋转驱动单元上并且关于所述装置的旋转中心旋转时，在所述装置中由于离心力而引起流体流动，所述微流体装置包括: 样品供给单元，具有容纳样品流体的样品室，所述样品流体包括流体和靶材料，在所述靶材料中细颗粒与所述样品流体中的靶细胞结合； 密度梯度分离单元，容纳具有比所述靶材料低的密度的密度梯度材料，其中所述密度梯度分离单元相比于所述样品室沿着径向方向更远离所述旋转中心； 流体供给通道，将所述样品供给单元与所述密度梯度分离单元流体性地耦接；以及 流体供给阀，在所述流体供给通道中，以选择性地允许所述样品流体流过所述流体供给通道， 其中所述密度梯度分离单元从所述样品供给单元接收所述样品流体，基于密度差异而从所述流体分离所述靶材料。
17.根据权利要求16所述的微流体装置，其中所述样品室包括分隔壁，所述分隔壁与所述样品室的顶壁和底壁中的至少一个一起形成瓶颈部以部分地限制所述样品流体在所述样品室的径向方向上的流动，其中所述瓶颈部与所述顶壁和所述底壁中的所述至少一个之间的间隙的大小或尺寸大于引起毛细现象的间隙的大小或尺寸，并且足够大而在混合工艺期间允许所述样品流体中的靶细胞和细颗粒通过所述间隙向后和向前移动，使得所述装置沿着顺时针方向和逆时针方向向后和向前旋转，并且在所述装置不旋转时部分地限制样品流体在向内的径向方向上的流动。
18.根据权利要求17所述的微流体装置，其中所述间隙的大小或尺寸介于大约0.5mm与大约20.0mm之间。·
19.根据权利要求17所述的微流体装置，其中 所述分隔壁具有其中所述瓶颈部从所述样品室的内部到所述样品室的外部在所述样品室的径向方向上变窄的形状。
20.根据权利要求19所述的微流体装置，其中 所述分隔壁在所述样品室的圆周方向上跨过所述样品室的宽度而形成。
21.根据权利要求17所述的微流体装置，其中 所述分隔壁在所述样品室的圆周方向上跨过所述样品室的宽度的一部分而形成。
22.根据权利要求17所述的微流体装置，其中 多个所述分隔壁布置在所述样品室的圆周方向上，其中所述分隔壁彼此间隔开，在相邻的分隔壁之间具有开口。
23.根据权利要求22所述的微流体装置，其中 每个所述开口在所述径向方向上从所述样品室的内部到所述样品室的外部变窄。
24.根据权利要求16所述的微流体装置，其中 所述密度梯度分离单元包括: 分离室，通过流体供给通道与所述样品室耦接并且容纳所述密度梯度材料， 恢复室，通过恢复通道连接至所述分离室并且恢复来自所述分离室的所述靶材料，以及恢复阀，在所述恢复通道中以选择性地控制所述流体流过所述恢复通道。
25.根据权利要求24所述的微流体装置，还包括: 废料室； 排放通道，设置在所述分离室上而在所述径向方向上比所述恢复通道更靠近所述旋转中心并且将所述分离室与所述废料室流体性地耦接，以允许从所述分离室排放所述流体的设置在所述靶材料之上的部分；以及 排放阀，在所述排放通道中以控制所述流体流过所述排放通道。
26.根据权利要求16所述的微流体装置，其中 所述样品供给单元包括细颗粒室、第一通道以及第一阀，所述细颗粒室容纳所述细颗粒，所述第一通道将所述样品室与所述细颗粒室流体性地耦接，所述第一阀在所述第一通道中以选择性地允许所述细颗粒流入到所述样品室中，以及其中所述密度梯度分离单元与所述样品室流体性地耦接。
27.根据权利要求26所述的微流体装置，其中 在所述样品室中所述样品由于离心力而被分离成多个层，以及 所述层包括包含所述靶细胞的靶层和位于所述靶层之上的上材料层，以及 其中所述微流体装置还包括: 废料室； 第二通道，将所述样品室与所述废料室流体性地耦接；以及 第二阀，用于选择性地打开 所述第二通道， 其中所述上材料层通过所述第二通道被排放至所述废料室。
28.根据权利要求27所述的微流体装置，还包括: 第三阀，在所述第二通道中并且比所述第二阀更靠近所述废料室，使得当所述上材料层被排放时，所述第三阀关闭所述第二通道。
29.根据权利要求28所述的微流体装置，还包括: 第四阀，在所述第二通道中以顺序地关闭和打开所述第二通道。
30.根据权利要求16所述的微流体装置，还包括: 溶胞液室，用于提供溶胞液以溶解所述样品中的特定细胞。
31.根据权利要求16所述的微流体装置，其中 所述样品室容纳所述样品和第一密度梯度材料，由于离心力而使包括所述靶细胞的靶层位于所述第一密度梯度材料之上，以及 其中所述样品供给单元还包括从所述样品室接收包括所述靶层的流体的反应室，使得所述流体与所述细颗粒混合而形成所述靶材料。
32.根据权利要求16所述的微流体装置，其中 所述靶细胞包括循环肿瘤细胞、癌症干细胞或者癌细胞。
【文档编号】G01N33/531GK103852577SQ201310418686
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2012年11月28日
【发明者】金玟锡, 朴钟勉 申请人:三星电子株式会社