一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法，包括血浆制备，及无热原水稀释，然后加热处理，其特征在于在不同水浴加热温度及时间下，通过超声分散后采用显色基质法来检测血浆中的细菌内毒素含量。该检测方法具有灵敏度高、检测结果可靠和检测效率高的优点。
【专利说明】一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细菌内毒素检测【技术领域】，具体涉及了一种通过超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法。
【背景技术】
[0002]内毒素(endotoxin),又称脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),是革兰氏阴性菌生长时释放和死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质，是革兰阴性细菌外膜的重要组成部分，它和磷脂双层、脂蛋白等共同构成革兰阴性细菌的细胞外膜。LPS是一个由多糖和类脂A(lipid A)构成的生物大分子，整个分子可分成三个明确的区域:0_特异性多糖链(0-specific polysaccharide chain),核心多糖(core polysaccharide)和 Lipid A0 细菌内毒素系在理化特性上属于兼具亲水性与疏水性的两性分子，携带正电与负电荷。内毒素是一类具有高度活性的分子，对机体具有广泛的生物学作用。内毒素对机体可引发一系列的毒害作用，是热原反应的主要诱因，极微量(纳克级)内毒素进入人体就会引起高热，血管扩张，甚至昏厥或死亡。内毒素血症是由于革兰氏阴性菌外细胞壁上的内毒素释放到血液中引起的，可出现于多种疾病过程中，如:大面积烧伤、重症肝炎、肝硬化等疾病。内毒素血症是临床最常见的致死疾病之一，其使机体免疫功能严重受损，并能引起休克、弥漫性血管内凝血、多器官功能衰竭等一系列严重的病理变化，最终导致器官坏死、不可逆休克和死亡。死亡率可达40%?90%。
[0003]由于内毒素含有负电荷、脂质和碳水化合物，因此血浆中已知许多蛋白质与内毒素结合并干扰鲎试验。具体说来，与内毒素结合的蛋白质在标准试验中可引起抑制或增强，导致假阳性和假阴性结果并影响精度。例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂(如大豆胰蛋白酶抑制齐U、α 2纤维蛋白溶解酶抑制剂、α 2巨球蛋白、抑肽酶、抗纤溶酶、抗凝血酶II1、抗胰蛋白酶和水蛭素)妨碍内毒素的检测方法。常用的血浆标本干扰物的去除方法有:氯仿法，酸化法，稀释加热法，乙醚加热法和硫酸铵法。
[0004]目前检测内毒素的主要试剂是鲎试剂，基于鲎试剂的检测方法包括:凝胶法、显色法和浊度法。内毒素与鲎试剂接触后，能引发一系列的级联反应，最终激活鲎试剂中的凝固酶原，从而导致鲎试剂的凝固。凝胶法用于定性测试，显色法和浊度法可以用于内毒素的定量测定。显色基质法的敏感度与精确度均比其它方法优越，客观上已达到定量检测，并且仅需少量鲎试剂，是目前内毒素检测的最佳方法。
[0005]内毒素单体的分子量在10000道尔顿左右。有文献报道，内毒素分子很少能够解聚到单体，而倾向于以二聚体的形式稳定存在，因此内毒素单体的分子量为10000到20000道尔顿左右。以内毒素单体或二聚体为基本单位，在二价金属阳离子(如Ca2+，Mg2+)等作用下，会形成胶束(分子量可以从30万到100万道尔顿左右)或者胶囊(分子量大于100万道尔顿)。LPS在溶液中用漩涡振荡器一般达不到完全解聚的目的，从而影响血浆中的细菌内毒素含量检测的灵敏度和检测效率。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是要提供一种测定血浆中细菌内毒素含量的方法，该方法中的血浆经过超声分散处理后，其内毒素分散均匀，有利于细菌内毒素的检测，从而提高检测的灵敏度和检测效率。
[0007]本发明提供的一种测定血浆中细菌内毒素含量的方法通过以下技术方案来实现:
[0008]一种测定血浆中细菌内毒素含量的方法，包括以下过程:血浆制备、稀释，取样进行热处理、冷却后分散处理，再与鲎试剂混合，通过显色基质法测定血浆中的内毒素，其特征在于该检测方法中的分散处理为超声处理。
[0009]上述血浆制备过程中得到的血浆可以为富血小板的血浆(PRP)或贫血小板的血浆(PPP)。稀释过程中使用的稀释剂为无热原水；稀释倍数为10倍。热处理过程中温度为25?100°C;热处理时间为5?15min。超声处理过程的超声频率为20?40kHz，超声时间为 5 ?15min。
[0010]上述测定血浆中细菌内毒素含量的方法包括的具体步骤为:取含肝素钠抗凝剂的血液样本，在0°c?10°C下，以100倍重力加速度(g)离心IOmin后，吸出上层液得富血小板的血浆(PRP)，用无热原水制成10倍稀释液，25?100°C加热处理5?15min，再经冰浴冷却后，冰浴超声处理5?15min，超声频率为20?40kHz，即得检测样本I，最后取0.1ml检测样本与鲎试剂混合通过显色基质法测定血浆中的内毒素含量。
[0011]进一步地，上述方法还可以选用贫血小板的血浆替代，具体步骤为:取含肝素钠抗凝剂的血液样本，在0°c?10°C下，以1000倍重力加速度(g)离心IOmin后，吸出上层液得贫血小板的血浆(PPP)，用无热原水制成10倍稀释液，25?100°C加热处理5?15min，再经冰浴冷却后，冰浴超声处理5?15min，超声频率为20?40kHz，即得检测样本II，最后取0.1ml检测样本与鲎试剂混合通过显色基质法测定血浆中的内毒素含量。
[0012]所述血浆中细菌内毒素的检测方法，其采用的是终点显色基质光度测定法。
[0013]上述的超声辅助法也可以用于除血浆之外的其他体液细菌内毒素的检测，如脑脊液、尿液、腹水、乳汁或病灶组织渗出液的细菌内毒素的检测。
[0014]本发明提供的技术方案，其原理是:在适宜的条件下(温度，pH值及无干扰物质)，鲎试剂中的C因子被体液样本中的微量细菌内毒素激活，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺(ρΝΑ，λ = 405nm)。在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺(pNA)可用偶氮化试剂染成玫瑰红色(λ =545nm)，避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。
[0015]本发明提供的技术方案具有如下有益效果:
[0016]1.本发明提供的稀释加热法，能消除血浆中的干扰成分，如蛋白酶类，菌体抗体类，抗凝血酶III，脂蛋白，尿激酶等对鲎试剂反应的干扰，避免内毒素处理剂的不足与麻烦，从而实现对血浆细菌内毒素的定性和定量检测。
[0017]2.本发明提供的超声辅助，使血浆中的细菌内毒素这种疏水物质能很好地溶解和分散在反应体系中，提供检测结果的可靠性。
[0018]3.本发明提供的检测方法，以血浆样本为例，进行十倍稀释，有利于消除干扰。[0019]4.本发明提供的检测方法，一方面采用特定的血浆样本进行制备方法，有利于消除干扰，同时通过超声辅助，可以使内毒素均匀分散，有利于提高检测的准确性；另一方面，在检测过程中，采用外加已知浓度的内毒素标准溶液进行回收率检测试验，可进一步验证检测的准确性，从而确保人体液细菌内毒素检测的可靠性，实现对人体液细菌内毒素的定性、定量检测。
[0020]5.本发明提供的血浆细菌内毒素检测方法，其回收率检测试验测得的回收率达70% -120%，比国家标准要求的50% -200%更加准确，而且采用的本法的超声辅助血浆细菌内毒素检测，可以简便、快速的进行血浆细菌内毒素的检测，提高检测效率。
[0021]6.采用本发明提供的超声辅助进行血浆细菌内毒素检测，通过光度法测定，可实现对细菌内毒素的鉴别率达100%，同时具有检测灵敏度高的特点，达0.01EU/mL。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]附图1所示为血浆内毒素含量检测标准曲线图。
【具体实施方式】
[0023]本发明是通过下面的具体实施例进行描述，通过具体实施例可以更好的理解本发明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
[0024]实施例1
[0025]细菌内毒素含量标准曲线制作:
[0026]步骤1、配制细菌内毒素标准溶液
[0027]标准曲线所采用的内毒素浓度梯度可以为0.01，0.025，0.05，0.075，0.lEU/mL或0.1,0.25,0.5,0.75,1.0EU/mL。其稀释方法如下(以 0.1，0.25，0.5，0.75，1.0EU/mL 梯度为例):取细菌内毒素工作品I支，按细菌内毒素工作品使用说明书稀释为10EU/mL的内毒素溶液，再稀释为1.0EU/mL的内毒素溶液，以1.0EU/mL的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.10,0.25,0.5,0.75,1.0EU/mL 的浓度梯度，见表 I。
[0028]表1、细菌内毒素标准溶液配制表
[0029]
【权利要求】
1.一种测定血浆中细菌内毒素含量的方法，包括以下过程:血浆制备、稀释，取样进行热处理、冷却后分散处理，再与鲎试剂混合，通过显色基质法测定血浆中的内毒素，其特征在于所述分散处理为超声处理。
2.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述血浆制备过程中得到的血浆为富血小板的血浆或贫血小板的血浆。
3.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述稀释过程中使用的稀释剂为无热原水；稀释倍数为10倍。
4.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述热处理过程中温度为25?100 V ;热处理时间为5?15 min。
5.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述超声处理过程的超声频率为20?40 kHz，超声时间为5?15 min。
6.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于包括以下步骤:取含肝素钠抗凝剂的血液样本，在(TC?10°C下，以100倍重力加速度离心10 min后，吸出上层液得富血小板的血浆(PRP)，用无热原水制成10倍稀释液，25?100°C加热处理5?15min，再经冰浴冷却后，冰浴超声处理5?15 min，超声频率为2(T40 kHz，即得检测样本I，最后取0.1ml检测样本与鲎试剂混合通过显色基质法测定血浆中的内毒素含量。
7.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于包括以下步骤:取含肝素钠抗凝剂的血液样本，在0°C?10°C下，以1000倍重力加速度离心10 min后，吸出上层液得贫血小板的血浆(PPP)，用无热原水制成10倍稀释液，25?100°C加热处理5?15 min，再经冰浴冷却后，冰浴超声处理5?15 min，超声频率为2(T40 kHz，即得检测样本II，最后取0.1ml检测样本与鲎试剂混合通过显色基质法测定血浆中的内毒素含量。
8.根据权利要求1所述的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，其特征在于所述显色基质法采用的是终点显色基质光度测定法。
9.权利要求1-8中任一项的测定血浆中细菌内毒素含量的方法，所述方法也可以用于脑脊液、尿液、腹水、乳汁或病灶组织渗出液的细菌内毒素的检测。
【文档编号】G01N21/31GK103454235SQ201310420368
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】陈校园, 李永桂, 邓永杰, 何楚华 申请人:广州康盛生物科技有限公司