一种筛选组织蛋白酶b抑制剂高通量筛选方法
一种筛选组织蛋白酶b抑制剂高通量筛选方法
【专利摘要】本发明发现了一种筛选组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)组织蛋白酶B抑制剂筛选模型的建立与优化：通过实验确定组织蛋白酶B最适浓度与反应时间；(2)阳性药验证模型可靠性：用缓冲液梯度稀释阳性药，用0.1％Brij L23配制组织蛋白酶B工作液，使其终浓度为1μg/ml；同样配制浓度为3.33μM的底物工作液，分别快速加入反应板中；10min后，检测Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40℃。数据分析计算出阳性药IC50。利用该方法能快速的筛选出组织蛋白酶B抑制剂，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
【专利说明】一种筛选组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了组织蛋白酶B抑制剂的高通 量筛选模型，用于待测样品对组织蛋白酶B抑制活性的高通量检测。
【背景技术】
[0002] 组织蛋白酶（cath印sin)在各种动物组织的细胞内（特别是溶酶体部分）发现的 一类蛋白酶。组织蛋白酶B催化苯甲酰-L-精氨酰胺的水解。其活性的表现需要巯基化合 物（SH化合物）的存在，最适pH在6附近。近年来研究表明组织蛋白酶B是细胞溶酶体内 的一种半胱氨酸蛋白酶，其可分布于肿瘤细胞的胞浆内，可降解层连蛋白、纤连蛋白、VI型 胶原等细胞外基质成分，并可促进肿瘤血管的形成，是恶性肿瘤侵袭转移的关键酶之一。因 此组织蛋白酶B是癌症治疗的新的靶点，其抑制剂可能对改善预后，延长生存期有帮助。本 方法目的为建立组织蛋白酶B抑制剂快速准确的筛选模型，并且可以在大量未知化合物中 寻找到先导化合物，从而节省过多试剂消耗，运用在高通量筛选中。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于建立一种基于荧光的组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选模型，具 有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0004] 本发明的技术方案：采用荧光方法建立体外组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选模 型，初筛，复筛发现一类具有抑制组织蛋白酶B活性的候选化合物。具体步骤如下：
[0005] 本发明利用荧光的方法建立了一种组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选模型。
[0006] 步骤一：组织蛋白酶B抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0007] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0008] 步骤三：高通量筛选模型验证。
【专利附图】
【附图说明】：
[0009] 图1:组织蛋白酶B浓度梯度优化实验结果。（n=3, [土幻
[0010] 图2:组织蛋白酶B温孵时间优化实验结果。（n=3,;土
[0011] 图3 :阳性药对组织蛋白酶B的抑制曲线图。（n=3, ;土^
[0012] 图4:高通量筛选Z'值分布。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0014] 1.组织蛋白酶B抑制剂筛选方法建立
[0015] ⑴实验材料
[0016] CathepsinB(Calbiochem?,Germany) > Z-Arg-Arg-7-amid〇-4-methylcoumari n hydrochloride(Arg-Arg-7-AMC)、L-Cysteine hydrochloride monohydrate reagent grade(L-cys)、30%BrijL23、亮抑酶肤（leupetin)、EDTA(Sigma-Aldrich?,USA)、去离子 水，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾和其它化学试剂均为国产分析纯、384孔黑板（Coming,USA)、 枪头（Axygen，USA)
[0017] ⑵实验步骤
[0018] (1)最适酶浓度与反应时间确定
[0019]a.用1X缓冲液配制足量浓度为8mM的L-cys工作溶液，每孔加27ill。
[0020] b?用0? 1 %BrijL23配制不同浓度的2. 5XCathepsinB工作液，每孔加入36ii1， 使Cath印sinB的终浓度为1，0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0iig/ml。
[0021] (3.用0.1%81^_123稀释底物母液，至浓度为3.331^的工作液。每孔27111， 快速加入。检测12min内，Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40°C。对结果作 图，选取窗口大，酶用量小，并且反应时间较短的CathepsinB浓度为最适浓度，并选取能够 达到最大信号值80%的时间为反应时间。
[0022] (2)阳性药IC50检测
[0023]a.用IX缓冲液配制足量含有2. 4mML-cys的缓冲液，用此缓冲液梯度稀释阳性 药Leupetin，每孔加入27y1。
[0024] 13.用0.1%&^」123配制2.5\0&让印811^工作液，每孔加入36111，使其终浓度 为1Ug/ml;同样配制浓度为3. 33yM的底物工作液，每孔27iil，快速加入。
[0025]c.检测lOmin时，Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40°C。计算 LeupetinIC50〇
[0026] 2?数据处理
[0027] (1)根据公式计算各孔的相对抑制率
[0028]
【权利要求】
1. 一种组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 蛋白酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为组织蛋白酶B。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中进行确定最适酶浓度与反应时间 的实验。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，用IX缓冲液配制足量浓度为 8mM的L-cys工作溶液，每孔加27 yl，用0. 1 % Bri j L23配制不同浓度的2. 5 X组织蛋白酶 B工作液，每孔加入36 iil，使组织蛋白酶B的终浓度为1，0.5,0.25,0. 125,0.0625, Oil g/ ml，用0.1 % Brij L23稀释底物母液，至浓度为3. 33 yl M的工作液，每孔27 yl，快速加 入，检测12min内，Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40°C，对结果作图，选取窗 口大，酶用量小，并且反应时间较短的组织蛋白酶B浓度为最适浓度，并选取能够达到最大 信号值80 %的时间为反应时间。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2)选用步骤（1)所到的组织蛋白酶 B浓度为最适浓度为0. g/ml，最佳反应时间为lOmin，用IX缓冲液配制足量含有2. 4mM L-cys的缓冲液，用缓冲液梯度稀释阳性药亮抑酶肽，每孔加入27 iil，用0. 1 % Bri j L23配 制2.5\组织蛋白酶8工作液，每孔加入36111，使其终浓度为111§/1111;同样配制浓度为 3. 33iiM的底物工作液，每孔27iil，快速加入，检测lOmin时，Ex348nM，Em440nM处的荧光 强度，反应温度为40°C。计算阳性药亮抑酶肽IC5(I为11. 9nM。
6. 权利要求1-5中任一所述的方法在筛选组织蛋白酶B抑制剂的应用。
【文档编号】G01N21/64GK104458668SQ201310421010
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】严明, 张陆勇, 胡洁, 高鹏 申请人:中国药科大学
【专利摘要】本发明发现了一种筛选组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)组织蛋白酶B抑制剂筛选模型的建立与优化：通过实验确定组织蛋白酶B最适浓度与反应时间；(2)阳性药验证模型可靠性：用缓冲液梯度稀释阳性药，用0.1％Brij L23配制组织蛋白酶B工作液，使其终浓度为1μg/ml；同样配制浓度为3.33μM的底物工作液，分别快速加入反应板中；10min后，检测Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40℃。数据分析计算出阳性药IC50。利用该方法能快速的筛选出组织蛋白酶B抑制剂，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
【专利说明】一种筛选组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了组织蛋白酶B抑制剂的高通 量筛选模型，用于待测样品对组织蛋白酶B抑制活性的高通量检测。
【背景技术】
[0002] 组织蛋白酶（cath印sin)在各种动物组织的细胞内（特别是溶酶体部分）发现的 一类蛋白酶。组织蛋白酶B催化苯甲酰-L-精氨酰胺的水解。其活性的表现需要巯基化合 物（SH化合物）的存在，最适pH在6附近。近年来研究表明组织蛋白酶B是细胞溶酶体内 的一种半胱氨酸蛋白酶，其可分布于肿瘤细胞的胞浆内，可降解层连蛋白、纤连蛋白、VI型 胶原等细胞外基质成分，并可促进肿瘤血管的形成，是恶性肿瘤侵袭转移的关键酶之一。因 此组织蛋白酶B是癌症治疗的新的靶点，其抑制剂可能对改善预后，延长生存期有帮助。本 方法目的为建立组织蛋白酶B抑制剂快速准确的筛选模型，并且可以在大量未知化合物中 寻找到先导化合物，从而节省过多试剂消耗，运用在高通量筛选中。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于建立一种基于荧光的组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选模型，具 有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0004] 本发明的技术方案：采用荧光方法建立体外组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选模 型，初筛，复筛发现一类具有抑制组织蛋白酶B活性的候选化合物。具体步骤如下：
[0005] 本发明利用荧光的方法建立了一种组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选模型。
[0006] 步骤一：组织蛋白酶B抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0007] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0008] 步骤三：高通量筛选模型验证。
【专利附图】
【附图说明】：
[0009] 图1:组织蛋白酶B浓度梯度优化实验结果。（n=3, [土幻
[0010] 图2:组织蛋白酶B温孵时间优化实验结果。（n=3,;土
[0011] 图3 :阳性药对组织蛋白酶B的抑制曲线图。（n=3, ;土^
[0012] 图4:高通量筛选Z'值分布。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0014] 1.组织蛋白酶B抑制剂筛选方法建立
[0015] ⑴实验材料
[0016] CathepsinB(Calbiochem?,Germany) > Z-Arg-Arg-7-amid〇-4-methylcoumari n hydrochloride(Arg-Arg-7-AMC)、L-Cysteine hydrochloride monohydrate reagent grade(L-cys)、30%BrijL23、亮抑酶肤（leupetin)、EDTA(Sigma-Aldrich?,USA)、去离子 水，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾和其它化学试剂均为国产分析纯、384孔黑板（Coming,USA)、 枪头（Axygen，USA)
[0017] ⑵实验步骤
[0018] (1)最适酶浓度与反应时间确定
[0019]a.用1X缓冲液配制足量浓度为8mM的L-cys工作溶液，每孔加27ill。
[0020] b?用0? 1 %BrijL23配制不同浓度的2. 5XCathepsinB工作液，每孔加入36ii1， 使Cath印sinB的终浓度为1，0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0iig/ml。
[0021] (3.用0.1%81^_123稀释底物母液，至浓度为3.331^的工作液。每孔27111， 快速加入。检测12min内，Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40°C。对结果作 图，选取窗口大，酶用量小，并且反应时间较短的CathepsinB浓度为最适浓度，并选取能够 达到最大信号值80%的时间为反应时间。
[0022] (2)阳性药IC50检测
[0023]a.用IX缓冲液配制足量含有2. 4mML-cys的缓冲液，用此缓冲液梯度稀释阳性 药Leupetin，每孔加入27y1。
[0024] 13.用0.1%&^」123配制2.5\0&让印811^工作液，每孔加入36111，使其终浓度 为1Ug/ml;同样配制浓度为3. 33yM的底物工作液，每孔27iil，快速加入。
[0025]c.检测lOmin时，Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40°C。计算 LeupetinIC50〇
[0026] 2?数据处理
[0027] (1)根据公式计算各孔的相对抑制率
[0028]
【权利要求】
1. 一种组织蛋白酶B抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 蛋白酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为组织蛋白酶B。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中进行确定最适酶浓度与反应时间 的实验。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，用IX缓冲液配制足量浓度为 8mM的L-cys工作溶液，每孔加27 yl，用0. 1 % Bri j L23配制不同浓度的2. 5 X组织蛋白酶 B工作液，每孔加入36 iil，使组织蛋白酶B的终浓度为1，0.5,0.25,0. 125,0.0625, Oil g/ ml，用0.1 % Brij L23稀释底物母液，至浓度为3. 33 yl M的工作液，每孔27 yl，快速加 入，检测12min内，Ex348nM，Em440nM处的荧光强度，反应温度为40°C，对结果作图，选取窗 口大，酶用量小，并且反应时间较短的组织蛋白酶B浓度为最适浓度，并选取能够达到最大 信号值80 %的时间为反应时间。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2)选用步骤（1)所到的组织蛋白酶 B浓度为最适浓度为0. g/ml，最佳反应时间为lOmin，用IX缓冲液配制足量含有2. 4mM L-cys的缓冲液，用缓冲液梯度稀释阳性药亮抑酶肽，每孔加入27 iil，用0. 1 % Bri j L23配 制2.5\组织蛋白酶8工作液，每孔加入36111，使其终浓度为111§/1111;同样配制浓度为 3. 33iiM的底物工作液，每孔27iil，快速加入，检测lOmin时，Ex348nM，Em440nM处的荧光 强度，反应温度为40°C。计算阳性药亮抑酶肽IC5(I为11. 9nM。
6. 权利要求1-5中任一所述的方法在筛选组织蛋白酶B抑制剂的应用。
【文档编号】G01N21/64GK104458668SQ201310421010
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】严明, 张陆勇, 胡洁, 高鹏 申请人:中国药科大学
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