一种筛选钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选方法
一种筛选钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选方法
【专利摘要】本发明发现了一种钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)钙激活中性蛋白酶-1抑制剂筛选模型的建立与优化：通过实验确定钙激活中性蛋白酶-1最适反应浓度；(2)阳性药验证模型可靠性：配制不同浓度的阳性药，每孔加入5ul；配制2×底物试剂，加样前加入一定量的Cac12，每孔加入10ul；配制一定量最佳浓度的蛋白酶，每孔加入5ul；室温反应20分钟后检测化学发光，得到不同浓度阳性药所对应的抑制率，使用作图软件求算半数抑制率IC50。本方法使用Suc-LLVY-aminoluciferin化学发光Calpain-1底物，在缓冲体系中对Calpain-1和荧光素酶活性进行优化。加入Calpin-Glo试剂后Calpain-1剪切底物，产生辉光型化学发光信号。在这个均相的酶联反应体系中，化学发光信号值与酶的活性成比例变化。该方法简便快捷；化学发光信号强，灵敏度高；分析结果稳定可靠，重现性好。
【专利说明】一种筛选钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用化学发光检测技术，构建了钙激活中性蛋白 酶-l(calpain-l)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对钙激活中性蛋白酶-1活性的 高通量检测。
【背景技术】
[0002] Calpain-1是钙激活的半胱氨酸蛋白酶家族成员，参与一大类的蛋白质的剪切过 程。通过催化蛋白水解作用调节底物蛋白活性，Calpain-1在钙离子信号转导过程中起重 要作用。Calpain-1参与在许多钙调节的细胞生理过程中：细胞运动，细胞周期，细胞增殖、 凋亡、坏死、分化，膜融合和血小板的激活。Calpain-1还参与许多病例过程，是重要的治疗 靶位点。诸如心肌梗塞，中风和脑外伤引起的钙离子稳态破坏导致的Calpain活性失调会 造成组织破坏。
[0003] 本方法使用Suc-LLVY-aminoluciferin化学发光Calpain-1底物，在缓冲体系中 对Calpain-1和荧光素酶活性进行优化。加入Calpin-Glo试剂后Calpain-1剪切底物，产 生辉光型化学发光信号。在这个均相的酶联反应体系中，化学发光信号值与酶的活性成比 例变化。该方法灵敏度高，简便快捷，重复性好，适用于高通量筛选。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于建立一种化学发光的钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选 模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0005] 本发明的技术方案：采用化学发光方法建立体外钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高 通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制钙激活中性蛋白酶-1活性的候选化合物。具 体步骤如下：
[0006] 本发明利用化学发光的方法建立了一种钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选 模型。
[0007] 步骤一：钙激活中性蛋白酶-1抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0008] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0009] 步骤三：高通量筛选模型验证。
【专利附图】
【附图说明】：
[0010] 图1:钙激活中性蛋白酶-1的最适浓度优化实验结果。（n=3,
[0011] 图2:阳性药对钙激活中性蛋白酶-1的抑制曲线图。（n=3,[迅；
[0012] 图3 :高通量筛选Z'值分布。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0014] 1.钙激活中性蛋白酶-1抑制剂筛选方法建立
[0015] ⑴实验材料
[0016] 缓冲液（Promega，USA)、底物（Promega，USA)、检测试剂（Promega，USA)丐激活中 性蛋白酶 _l，P〇rcineErythrocytes(Sigma-aldrich，USA)、氯化f丐，DMSO(Sigma-aldrich， USA)
[0017] 1)确定钙激活中性蛋白酶-1的最适浓度
[0018] a.配制不同浓度梯度的蛋白酶，每孔加入5ill。
[0019] b.配制2X底物试剂，室温平衡30分钟，加样前加入一定量的Cacl2，每孔加入 10 u 1〇
[0020] c.配制实验所耐受浓度的DMS0溶液，每孔加入5ii1，使最终反应体系为20ii1。
[0021] d?室温反应20分钟后检测化学发光。
[0022] e.对结果进行处理，在蛋白酶浓度-信号曲线的线性范围内取最佳的蛋白酶浓度 作为后续实验的条件。
[0023] 2)阳性药特征曲线
[0024] a.配制不同浓度的阳性药，每孔加入5ill。
[0025] b.配制2X底物试剂，加样前加入一定量的Cacl2，每孔加入lOiil。
[0026] c.配制一定量最佳浓度的蛋白酶，每孔加入5ii1。
[0027] d?室温反应20分钟后检测化学发光。
[0028] 2?数据处理
[0029] (1)根据公式计算各孔的相对抑制率
[0030]
【权利要求】
1. 一种钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 蛋白酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为钙激活中性蛋白酶-1。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中进行确定钙激活中性蛋白酶-1 的最适浓度实验。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，配制不同浓度梯度的蛋白酶，每 孔加入5 ill ;配制2 X底物试剂，室温平衡30分钟，加样前加入一定量的Cacl2，每孔加入 10 U 1 ;配制实验所耐受浓度的DMSO溶液，每孔加入5 y 1，使最终反应体系为20 ii 1 ;室温 反应20分钟后检测化学发光，可得到最佳反应所需的钙激活中性蛋白酶-1浓度为50nM。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)选用步骤（1)所到的合适浓度的 钙激活中性蛋白酶-1，然后配制不同浓度的阳性药，每孔加入5iU ;配制2X底物试剂，力口 样前加入一定量的Cacl2，每孔加入lOiil。配制一定量最佳浓度的蛋白酶，每孔加入5iil ; 室温反应20分钟后检测化学发光。数据处理，得出阳性药的IC5Q为113. 5nM。
6. 权利要求1-5中所述任一所述的方法在筛选钙激活中性蛋白酶-1抑制剂的应用。
【文档编号】G01N21/76GK104458709SQ201310421022
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】严明, 张陆勇, 胡洁, 高鹏 申请人:中国药科大学
【专利摘要】本发明发现了一种钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)钙激活中性蛋白酶-1抑制剂筛选模型的建立与优化：通过实验确定钙激活中性蛋白酶-1最适反应浓度；(2)阳性药验证模型可靠性：配制不同浓度的阳性药，每孔加入5ul；配制2×底物试剂，加样前加入一定量的Cac12，每孔加入10ul；配制一定量最佳浓度的蛋白酶，每孔加入5ul；室温反应20分钟后检测化学发光，得到不同浓度阳性药所对应的抑制率，使用作图软件求算半数抑制率IC50。本方法使用Suc-LLVY-aminoluciferin化学发光Calpain-1底物，在缓冲体系中对Calpain-1和荧光素酶活性进行优化。加入Calpin-Glo试剂后Calpain-1剪切底物，产生辉光型化学发光信号。在这个均相的酶联反应体系中，化学发光信号值与酶的活性成比例变化。该方法简便快捷；化学发光信号强，灵敏度高；分析结果稳定可靠，重现性好。
【专利说明】一种筛选钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用化学发光检测技术，构建了钙激活中性蛋白 酶-l(calpain-l)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对钙激活中性蛋白酶-1活性的 高通量检测。
【背景技术】
[0002] Calpain-1是钙激活的半胱氨酸蛋白酶家族成员，参与一大类的蛋白质的剪切过 程。通过催化蛋白水解作用调节底物蛋白活性，Calpain-1在钙离子信号转导过程中起重 要作用。Calpain-1参与在许多钙调节的细胞生理过程中：细胞运动，细胞周期，细胞增殖、 凋亡、坏死、分化，膜融合和血小板的激活。Calpain-1还参与许多病例过程，是重要的治疗 靶位点。诸如心肌梗塞，中风和脑外伤引起的钙离子稳态破坏导致的Calpain活性失调会 造成组织破坏。
[0003] 本方法使用Suc-LLVY-aminoluciferin化学发光Calpain-1底物，在缓冲体系中 对Calpain-1和荧光素酶活性进行优化。加入Calpin-Glo试剂后Calpain-1剪切底物，产 生辉光型化学发光信号。在这个均相的酶联反应体系中，化学发光信号值与酶的活性成比 例变化。该方法灵敏度高，简便快捷，重复性好，适用于高通量筛选。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于建立一种化学发光的钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选 模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0005] 本发明的技术方案：采用化学发光方法建立体外钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高 通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制钙激活中性蛋白酶-1活性的候选化合物。具 体步骤如下：
[0006] 本发明利用化学发光的方法建立了一种钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选 模型。
[0007] 步骤一：钙激活中性蛋白酶-1抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0008] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0009] 步骤三：高通量筛选模型验证。
【专利附图】
【附图说明】：
[0010] 图1:钙激活中性蛋白酶-1的最适浓度优化实验结果。（n=3,
[0011] 图2:阳性药对钙激活中性蛋白酶-1的抑制曲线图。（n=3,[迅；
[0012] 图3 :高通量筛选Z'值分布。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0014] 1.钙激活中性蛋白酶-1抑制剂筛选方法建立
[0015] ⑴实验材料
[0016] 缓冲液（Promega，USA)、底物（Promega，USA)、检测试剂（Promega，USA)丐激活中 性蛋白酶 _l，P〇rcineErythrocytes(Sigma-aldrich，USA)、氯化f丐，DMSO(Sigma-aldrich， USA)
[0017] 1)确定钙激活中性蛋白酶-1的最适浓度
[0018] a.配制不同浓度梯度的蛋白酶，每孔加入5ill。
[0019] b.配制2X底物试剂，室温平衡30分钟，加样前加入一定量的Cacl2，每孔加入 10 u 1〇
[0020] c.配制实验所耐受浓度的DMS0溶液，每孔加入5ii1，使最终反应体系为20ii1。
[0021] d?室温反应20分钟后检测化学发光。
[0022] e.对结果进行处理，在蛋白酶浓度-信号曲线的线性范围内取最佳的蛋白酶浓度 作为后续实验的条件。
[0023] 2)阳性药特征曲线
[0024] a.配制不同浓度的阳性药，每孔加入5ill。
[0025] b.配制2X底物试剂，加样前加入一定量的Cacl2，每孔加入lOiil。
[0026] c.配制一定量最佳浓度的蛋白酶，每孔加入5ii1。
[0027] d?室温反应20分钟后检测化学发光。
[0028] 2?数据处理
[0029] (1)根据公式计算各孔的相对抑制率
[0030]
【权利要求】
1. 一种钙激活中性蛋白酶-1抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 蛋白酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为钙激活中性蛋白酶-1。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中进行确定钙激活中性蛋白酶-1 的最适浓度实验。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，配制不同浓度梯度的蛋白酶，每 孔加入5 ill ;配制2 X底物试剂，室温平衡30分钟，加样前加入一定量的Cacl2，每孔加入 10 U 1 ;配制实验所耐受浓度的DMSO溶液，每孔加入5 y 1，使最终反应体系为20 ii 1 ;室温 反应20分钟后检测化学发光，可得到最佳反应所需的钙激活中性蛋白酶-1浓度为50nM。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)选用步骤（1)所到的合适浓度的 钙激活中性蛋白酶-1，然后配制不同浓度的阳性药，每孔加入5iU ;配制2X底物试剂，力口 样前加入一定量的Cacl2，每孔加入lOiil。配制一定量最佳浓度的蛋白酶，每孔加入5iil ; 室温反应20分钟后检测化学发光。数据处理，得出阳性药的IC5Q为113. 5nM。
6. 权利要求1-5中所述任一所述的方法在筛选钙激活中性蛋白酶-1抑制剂的应用。
【文档编号】G01N21/76GK104458709SQ201310421022
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】严明, 张陆勇, 胡洁, 高鹏 申请人:中国药科大学
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