Dc-signr的一种新用途
【专利摘要】本发明提供了DC-SIGNR蛋白在制备鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查结直肠癌及其转移情况的产品中的应用。本发明通过ELISA实验检测结直肠癌患者血清及正常人血清中DC-SIGNR蛋白浓度，结果发现结直肠癌患者血清中DC-SIGNR蛋白浓度显著高于正常人（P<0.0001）；结直肠癌转移患者血清中DC-SIGNR蛋白浓度高于未发生转移的结直肠癌患者（P=0.0002）。同时，又对结肠癌和直肠癌患者分别进行进一步分析，证实了患者血清中DC-SIGNR蛋白浓度水平对于结肠癌和直肠癌的诊断和转移与否的鉴别诊断均有不同程度的价值。因此，本发明具有巨大的社会意义和经济价值。
【专利说明】DC-SIGNR的一种新用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及DC-SIGNR蛋白在制备鉴别和/或诊断疾病的 产品中的用途。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，发生率仅次于胃癌和食道癌。在我国常见恶 性肿瘤死亡中，结直肠癌患者在男性占第五位，女性占第六位。近二十年来，结直肠癌的发 病率在逐年增加，同时，其发病年龄也趋向老龄化。然而，在西方发达国家，结直肠癌是仅次 于肺癌的第二位恶性肿瘤。结直肠癌的好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60%。 发病年龄多在60-70岁。
[0003] 近年来，虽然随着诊断技术发展，越来越多结直肠癌患者得以在早期发现并进行 相应治疗，然而即使在早期切除原发肿瘤后仍然有许多患者在日后会进展并发生全身转 移，并将最终导致患者的死亡。因此，对于结直肠癌转移的分子机制的了解是结直肠癌诊治 中的一项重要而迫切的任务。
[0004] DC-SIGNR(Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule 3-Grabbing Nonintegrin Related, Genbank accession number AF245219)属于2型膜 蛋白，DC-SIGNR高表达于肝窦内皮细胞和淋巴结窦内皮细胞，可表达于子宫内膜与胎盘。 DC-SIGNR与已知的C-型凝集素DC-SIGN、LSECtin和⑶23基因紧密成簇排列于染色体 19pl3. 3区域，同属于II型C-型凝集素家族。到前为止，关于DC-SIGNR与结直肠癌及其转 移的关系未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供DC-SIGNR蛋白在制备鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或 辅助筛查结直肠癌及其转移情况的产品中的应用。
[0006] 检测血清中DC-SIGNR蛋白浓度的产品在制备下述任一用途的产品中的应用也属 于本发明保护的范围：
[0007] 1)鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌；
[0008] 2)鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌；
[0009] 3)鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况；
[0010] 4)鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移和/或发展情况；
[0011] 5)筛查和/或辅助筛查结肠癌；
[0012] 6)筛查和/或辅助筛查直肠癌；
[0013] 所述检测血清中DC-SIGNR蛋白浓度的产品具体为检测DC-SIGNR蛋白的单克隆抗 体或多克隆抗体。
[0014] 所述DC-SIGNR蛋白，是如下a)或b)的蛋白：
[0015]a)序列表中的SEQIDNs.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0016] b)将序列表中的SEQ ID Ns . 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且具有上述1) -4)任一所述用途的由a)衍生的蛋白质。
[0017] DC-SIGNR蛋白作为标志物在开发和/或设计具有下述任一用途的产品中的应用 也属于本发明保护的范围：
[0018] 1)鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌；
[0019] 2)鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌；
[0020] 3)鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况；
[0021] 4)鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移和/或发展情况；
[0022] 5)筛查和/或辅助筛查结肠癌；
[0023] 6)筛查和/或辅助筛查直肠癌；
[0024] 所述DC-SIGNR蛋白，是如下a)或b)的蛋白：
[0025] a)序列表中的SEQ ID Ns . 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0026] b)将序列表中的SEQ ID Ns . 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且具有上述1) -4)任一所述用途的由a)衍生的蛋白质。
[0027] 所述应用中，所述鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌指鉴别、诊断和/或辅助诊断 结肠癌是否发生；
[0028] 所述应用中，所述鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌指鉴别、诊断和/或辅助诊断 直肠癌是否发生；
[0029] 所述应用中，所述鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况指鉴别、 诊断和/或辅助诊断结肠癌是否发生转移和/或处于早期还是进展期；
[0030] 所述应用中，所述鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移情况指鉴别、诊断和/或 辅助诊断直肠癌是否发生转移和/或处于早期还是进展期。
[0031] 所述应用中，所述转移具体指淋巴结转移或远端转移。
[0032] 本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，包括检测DC-SIGNR蛋白的单克隆抗体 或多克隆抗体；所述试剂盒还包括说明书，所述说明书上记载：若待测血清中DC-SIGNR蛋 白的含量显著高于正常人血清中DC-SIGNR蛋白的含量，则候选认为该待测血清样本患有 直肠癌或结肠癌，或发生直肠癌转移或结肠癌转移。
[0033] 所述试剂盒包括下述1) -3 ):
[0034]1)所述多克隆抗体为羊抗人DC-SIGNR多抗；
[0035]2)所述单克隆抗体为鼠抗人DC-SIGNR单抗；
[0036] 3 )辣根氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体；
[0037] 所述DC-SIGNR蛋白，是如下a)或b)的蛋白：
[0038]a)序列表中的SEQ ID Ns.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0039] b)将序列表中的SEQ ID Ns . 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且具有权利要求1所述的1) -4)中任一所述用途的由a)衍生 的蛋白质。
[0040] 所述试剂盒还包括下述1)_6):
[0041] 1)pH9. 6的碳酸盐缓冲液，其组成为：
[0042]Na2C03 1. 59g/L
[0043]NaHC03 2. 93g/L
[0044] 溶剂为蒸馈水；
[0045] 2)PBST:由 137mMNaCl，2. 7mMKC1，10mMNa2HP04, 2mMKH2P04 和体积百分含量 为5%的Tween-200组成，溶剂为三蒸水；
[0046] 3)脱脂奶粉；
[0047] 4)pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，具体组成为：137mMNaCl，2. 7mMKC1， 10mMNa2HP04,2mMKH2P04,溶剂为三蒸水；
[0048] 5)TMB显色液
[0049] 6) 2M浓硫酸，溶剂为三蒸水。
[0050] 本发明的再一个目的是提供所述试剂盒在制备具有下述任一用途的产品中的应 用：
[0051] 1)鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌；
[0052] 2)鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌；
[0053] 3)鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况；
[0054] 4)鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移和/或发展情况；
[0055]5)筛查和/或辅助筛查结肠癌；
[0056]6)筛查和/或辅助筛查直肠癌。
[0057] 所述的应用中，所述鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌指鉴别、诊断和/或辅助诊 断结肠癌是否发生；
[0058] 所述的应用中，所述鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌指鉴别、诊断和/或辅助诊 断直肠癌是否发生；
[0059] 所述的应用中，所述鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况指鉴 另IJ、诊断和/或辅助诊断结肠癌是否发生转移和/或处于早期还是进展期；
[0060] 所述的应用中，所述鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移情况指鉴别、诊断和/ 或辅助诊断直肠癌是否发生转移和/或处于早期还是进展期。
[0061] 所述的应用中，所述转移具体指淋巴结转移或远端转移。
[0062] 本发明提供了DC-SIGNR蛋白在制备鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查结 直肠癌及其转移情况的产品中的应用。本发明通过ELISA实验检测结直肠癌患者血清及正 常人血清中DC-SIGNR蛋白浓度，结果发现结直肠癌患者血清中DC-SIGNR蛋白浓度显著高 于正常人（P〈〇. 0001);结直肠癌转移患者血清中DC-SIGNR蛋白浓度高于未发生转移的结 直肠癌患者（P=〇. 0002)。同时，又对结肠癌和直肠癌患者分别进行进一步分析，证实了患者 血清中DC-SIGNR蛋白浓度水平对于结肠癌和直肠癌的诊断和转移与否的鉴别诊断均有不 同程度的价值。因此，本发明具有巨大的社会意义和经济价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0063] 图1为Controlsubject组与CRC组血清样本中DC-SIGNR蛋白浓度差异统计结 果图。
[0064] 图2为Controlsubject组与CC组血清样本中DC-SIGNR蛋白浓度差异统计结果 图。
[0065]图3为Controlsubject组与RC组血清样本中DC-SIGNR蛋白浓度差异统计结果 图。
[0066] 图4为利用血清中DC-SIGNR蛋白浓度诊断结直肠癌及其转移情况的R0C曲线图。
[0067] 图5为利用血清中DC-SIGNR蛋白浓度诊断结肠癌及其转移情况的R0C曲线图。
[0068] 图6为利用血清中DC-SIGNR蛋白浓度诊断直肠癌及其转移情况的R0C曲线图。
【具体实施方式】
[0069] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0070] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0071] DC-SIGNR蛋白的氨基酸序列见序列表中SEQ ID Ns :1所示。
[0072] 实施例1、利用DC-SIGNR蛋白诊断或辅助诊断结直肠癌发生及转移情况
[0073] 1 材料
[0074] 1. 1血清样本
[0075] 结直肠癌患者血清样本143例，且所有患者均经手术及病理确诊；正常体检者血 液样本122例，所有正常体检者肝功正常，HBV、HCV及HIV均为阴性。血清样本由大连医科 大学附属第一医院与大连医科大学附属第二医院提供，血清样本的取得均经过患者及体检 者的知情同意。
[0076] 1. 2ELISA检测试剂组成
[0077] 检测DC-SIGNR的试剂包括鼠抗人DC-SIGNR单抗购自R&D公司，羊抗人DC-SIGNR 多抗购自SantaCruz公司，兔抗山羊辣根过氧化物酶标记抗体购自北京中杉金桥生物技术 有限公司，TMB显色液购买于TIANGEN试剂公司。
[0078] 2 方法
[0079] 2. 1血液样本处理
[0080]-70°C保存的血清样本于室温放置溶解后作为待测样品用于检测。
[0081] 2.2ELISA检测
[0082] 采用ELISA方法检测待测样品中DC-SIGNR蛋白浓度，具体操作步骤如下：
[0083] 实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37°C溶解）；试剂或样品稀 释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样 品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
[0084] (1)包被：将羊抗人DC-SIGNR多抗与包被液按照体积比为1:750混合，将混合液 加入酶标板各孔中，每孔lOOul,酶标板加上盖或覆膜,4°C过夜。包被液为pH9. 6的碳酸盐 缓冲液，其组成为：
[0085]Na2C03 1. 59g/L
[0086]NaHC03 2. 93g/L
[0087] 溶剂为蒸馏水。
[0088] (2)洗板：弃去液体，甩干，用PBST洗板3次，每次浸泡5分钟，350ii1/每孔，轻拍 将孔内液体拍干。PBST的组成为：137mMNaCl，2. 7mMKCl，10mMNa2HP04,2mMKH2P04 和体积 百分含量为〇. 05%的Tween-200 (吐温-200)，溶剂为三蒸水。
[0089] (3)封闭：加封闭液，在酶标板上覆膜，37°C孵育1小时。封闭液为质量分数为5% 的脱脂奶粉，溶剂为PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7. 4,其组成为137mMNaCl，2. 7mM KCl，10mMNa2HP04,2mMKH2P04,溶剂为三蒸水。
[0090] (4)洗板：弃去液体，甩干，用PBST洗板3次，每次浸泡5分钟，350ill/每孔，轻拍 将孔内液体拍干。
[0091] (5)加样：分别设空白孔、待测样品孔和标准蛋白孔。空白孔加样品稀释液(样品 稀释液为pH值为7. 4的PBS缓冲液）100yl，待测样品孔加入体积比为1:1的待测样品与 样品稀释液的混合液100u1，标准蛋白孔加入适宜浓度梯度的稀释样品100u1。注意不要 有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上覆膜， 37°C孵育90分钟。待测样品孔及空白孔均做平行复孔。
[0092] (6)洗板：弃去液体，甩干，用PBST洗板3次，每次浸泡5分钟，350ii1/每孔，轻拍 将孔内液体拍干。
[0093] (7)加一抗：将鼠抗人DC-SIGNR单抗的PBS稀释液（PBS为上述pH值为7. 4的缓 冲液，按照鼠抗人DC-SIGNR单抗与PBS缓冲液体积比为1:1000稀释。）加入酶标板各孔中， 每孔100ul，酶标板加上覆膜，37°C孵育90分钟。
[0094] (8)洗板：弃去液体，甩干，用PBST洗板3次，每次浸泡5分钟，350ii1/每孔，轻拍 将孔内液体拍干。
[0095] (9)加二抗：将山羊抗鼠辣根标记过氧化物抗体的PBS稀释液加入酶标板各孔 中，每孔lOOul，酶标板加上覆膜，37°C孵育60分钟。二抗稀释液按照二抗与PBS体积比为 1:350稀释；所用PBS的组成同上述步骤（2)所述。
[0096] (10)洗板：弃去液体，甩干，用PBST洗板4次，每次浸泡5分钟，350ii1/每孔，轻 拍将孔内液体拍干。
[0097] (11)显色：将TMB显色液加入酶标板各孔中，每孔lOOul，酶标板加上覆膜，避光 37 °C孵育30分钟。
[0098] (12)终止：将2M浓硫酸(溶剂为三蒸水，即经三次蒸馏收集的水。）加入酶标板各 孔中，每孔50ul。
[0099] (13)酶标仪检测：用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（0D45Q值）。在 加终止液后立即进行检测。根据记录的待测样品和标准品的〇D45(l值计算得到DC-SIGNR的 蛋白浓度。计算公式为：Y=15536x-1192. 9，R2=0. 9784 (其中x为0D45Q值，Y为DC-SIGNR的 蛋白浓度)。
[0100] 3 结果
[0101] 结直肠癌患者血清中DC-SIGNR的检测结果见表1 ;正常人血清中DC-SIGNR的检 测结果见表2。
[0102] 表1结直肠癌患者血清中DC-SIGNR蛋白浓度检测结果及相关信息
[0103]
【权利要求】
1. 检测血清中DC-SIGNR蛋白浓度的产品在制备下述任一用途的产品中的应用： 1) 鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌； 2) 鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌； 3) 鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况； 4) 鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移和/或发展情况； 5) 筛查和/或辅助筛查结肠癌； 6) 筛查和/或辅助筛查直肠癌。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测血清中DC-SIGNR蛋白浓度的产 品具体为检测DC-SIGNR蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述DC-SIGNR蛋白，是如下a)或b) 的蛋白： a) 序列表中的SEQ ID Ns . 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中的SEQ ID Ns . 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且具有上述1) -4)任一所述用途的由a)衍生的蛋白质。 4. DC-SIGNR蛋白作为标志物在开发和/或设计具有下述任一用途的产品中的应用： 1) 鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌； 2) 鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌； 3) 鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况； 4) 鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移和/或发展情况； 5) 筛查和/或辅助筛查结肠癌； 6) 筛查和/或辅助筛查直肠癌； 所述DC-SIGNR蛋白，是如下a)或b)的蛋白： a) 序列表中的SEQ ID Ns . 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中的SEQ ID Ns . 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且具有上述1) -4)任一所述用途的由a)衍生的蛋白质。
5. 根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于： 所述鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌指鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌是否发生； 所述鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌指鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌是否发生； 所述鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况指鉴别、诊断和/或辅助诊 断结肠癌是否发生转移和/或处于早期还是进展期； 所述鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移情况指鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌是 否发生转移和/或处于早期还是进展期。
6. -种试剂盒，包括检测DC-SIGNR蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体；所述试剂盒还包 括说明书，所述说明书上记载：若待测血清中DC-SIGNR蛋白的含量显著高于正常人血清中 DC-SIGNR蛋白的含量，则候选认为该待测血清样本患有直肠癌或结肠癌，或发生直肠癌转 移或结肠癌转移。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括下述1) -3): 1) 所述多克隆抗体为羊抗人DC-SIGNR多抗； 2) 所述单克隆抗体为鼠抗人DC-SIGNR单抗； 3)辣根氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体； 所述DC-SIGNR蛋白，是如下a)或b)的蛋白： a) 序列表中的SEQ ID Ns . 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中的SEQ ID Ns . 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且具有权利要求1所述的1) -4)中任一所述用途的由a)衍生的蛋 白质。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括下述1) -6): 1. pH9. 6的碳酸盐缓冲液，其组成为： Na2C03 1. 59g/L NaHC03 2.93g/L 溶剂为蒸馏水； 2. PBST :由 137mM NaCl，2. 7mM KC1，10mM Na2HP04, 2mM KH2P04 和体积百分含量为 5% 的 Tween-200组成，溶剂为三蒸水； 3) 脱脂奶粉； 4) 口11值为7.4的磷酸盐缓冲液，具体组成为：1371111恥(：1，2.711111((：1，1〇1111似 2册04， 2mM KH2P04,溶剂为三蒸水； 5. TMB显色液； 6) 2M浓硫酸，溶剂为三蒸水。
9. 权利要求6-8任一所述试剂盒在制备具有下述任一用途的产品中的应用： 1) 鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌； 2) 鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌； 3) 鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况； 4) 鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移和/或发展情况； 5) 筛查和/或辅助筛查结肠癌； 6) 筛查和/或辅助筛查直肠癌。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于： 所述鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌指鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌是否发生； 所述鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌指鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌是否发生； 所述鉴别、诊断和/或辅助诊断结肠癌转移和/或发展情况指鉴别、诊断和/或辅助诊 断结肠癌是否发生转移和/或处于早期还是进展期； 所述鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌转移情况指鉴别、诊断和/或辅助诊断直肠癌是 否发生转移和/或处于早期还是进展期。
【文档编号】G01N33/68GK104459146SQ201310422361
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】左云飞, 任双义, 陈哲, 陈凯, 张竹青 申请人:大连医科大学