Hplc法分析蛹虫草子实体和残基中有效物含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，包括首先进行腺苷和虫草素标准溶液和蛹虫草子实体和其固体培养残基供试溶液的制备，然后在色谱柱为XBridgeTMC18(5μm,4.6x150mm)；流动相：甲醇、超纯水，体积比为10:90；流速：1.0ml/min；进样量：10μL(自动进样)；柱温：30℃；检测波长：254nm条件下分别测定蛹虫草子实体、固体培养残基供试溶液应呈现与腺苷虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰。本发明方法简便有效，特别适于分析人工培养蛹虫草子实体及其固体培养残基中的腺苷和虫草素含量，具有很好的重复性和稳定性。
【专利说明】HPLC法分析蛹虫草子实体和残基中有效物含量的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及到分析化学领域，特别涉及一种用HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，该方法特别适用于分析人工培养蛹虫草子实体和其固体培养残基。
【背景技术】
[0002]蛹虫草(又名北虫草、北冬虫夏草)子实体为麦角菌科虫草属真菌蛹草菌[Cordyc印smilitaris^Link)的干燥子座，是我国特有的名贵药用真菌，具有扩张器官、镇静、抗心律失常、降血压、抗病原微生物、抗恶性肿瘤等多种药理活性。腺苷、虫草素等核苷类成分被作为虫草质量的主要参考指标。腺苷(CltlH13N5O4)全称腺嘌呤核苷，是核酸的基本结构单位，它具有参与人体代谢和生理调节的功能。虫草素(CltlH13N5O3)又称虫草菌素、3 '-脱氧腺苷，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤、调节人体内分泌等作用。
[0003]目前蛹虫草的人工培植技术主要有液体发酵方式和以大米为基质的固体培养方式等，目前由于固体培养方式所需投资较小，简便易行，目前已在国内许多地区应用。对于固体培养过程中的附属产物-富含菌丝体的固体培养残基，目前还没有对其进行系统的开发利用，仍当作废物扔弃，造成资源的浪费，而蛹虫草在培植过程中固体培养残基是干子实体量的3~3.5倍，在蛹虫草子实体被采收后，仍有大量含有腺苷与虫草素等有效成分的菌丝残留在其中，因此对其进行开发研究是非常有必要的。
[0004]蛹虫草作为一种药食两用的真菌，因品种产地，培养条件等原因，其中所含有效成分不尽相同。而蛹虫草的固体培养残基有大量菌丝残留且成分复杂，其有效成分也有很大差异。蛹虫草中腺苷和虫草素的含量测定是虫草产品质量控制及代谢途径研究的前提。目前，蛹虫草及其固体培养残基中腺苷和虫草素的含量测定还没有统一的国标方法，因此确立一个简便可靠的方法一次性进样同时分析子实体与其固体培养残基中的腺苷和虫草素的含量具有现实意义。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，本发明的方法具有快速、准确测定蛹虫草子实体及其固体培养残基中腺苷和虫草素含量，有效控制人工培养蛹虫草产品质量的特点。
[0006]—种HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，包括以下步骤:
(I)腺苷和虫草素标准溶液的制备和蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制
备;
腺苷和虫草素标准溶液制备:称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品置于容器中，用水溶解并定容作为标准储备液，加超纯水将所述标准储备液稀释成若干不同浓度的腺苷和虫草素标准溶液； 分别制备蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液:将蛹虫草子实体烘干，经粉碎机粉碎后过筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末样品，加入提取液进行提取，提取结束后分离得上清液，即为蛹虫草子实体供试溶液；将蛹虫草固体培养残基烘干，经粉碎机粉碎后过筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草固体培养残基粉末样品，加入提取液进行提取，提取结束后分离得上清液，即为蛹虫草固体培养残基供试溶液；
(2)分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草子实体供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草子实体供试溶液应呈现与腺苷和虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草固体培养残基供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草固体培养残基供试溶液应呈现与腺苷虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；测试的色谱条件如下:色谱柱为XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流动相:甲醇、超纯水，体积比为10:90 ;流速:1.0 ml/min ;进样量:10 μ L,自动进样；柱温:30 V ;检测波长:254 nm。
[0007]在本发明的优选实施例中，所述腺苷和虫草素标准溶液制备方法为:精确称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品各4mg，准确到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作为标准储备液，浓度记为80 μ g/ml ;然后将所述标准储备液用超纯水稀释成2 μ g/ml>5 μ g/ml> 10 μ g/ml>20 μ g/ml>40 μ g/ml>80 μ g/ml 的腺苷和虫草素标准溶液。
[0008]在本发明的优选实施例中，所述蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备方法为:将蛹虫草子实体置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 0C >5000 r/min的离心机中离心15 min，吸取上清液I ml，经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤；将蛹虫草固体培养残基置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛,精确称取干燥至恒重的蛹虫草固体培养残基粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 °C,5000 r/min的离心机中离心15 min,吸取上清液I ml,经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤。本发明优选，提取液为水。
[0009]本发明还提供一种可作为分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量标准的HPLC分析方法，包括以下步骤:
(I)腺苷和虫草素标准溶液的制备和蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备；
腺苷和虫草素标准溶液制备:精确称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品各4mg，准确到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作为标准储备液，浓度记为80 μ g/ml ；然后将所述标准储备液用超纯水稀释成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和虫草素标准溶液；
蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备:将蛹虫草子实体置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 °C,5000 r/min的离心机中离心15 min,吸取上清液I ml,经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤；将蛹虫草固体培养残基置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草固体培养残基粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 0C >5000 r/min的离心机中离心15 min，吸取上清液I ml，经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤；
(2)分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草子实体供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草子实体供试溶液应呈现与腺苷和虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草固体培养残基供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草固体培养残基供试溶液应呈现与腺苷虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；测试的色谱条件如下:色谱柱为XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流动相:甲醇、超纯水，体积比为10:90 ;流速:1.0 ml/min ;进样量:10 μ L,自动进样；柱温:30 V ;检测波长:254 nm。
[0010]以上，所提到的腺苷和虫草素标准溶液的制备、蛹虫草子实体供试溶液、蛹虫草固体培养残基供试溶液制备不分先后。
[0011]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
本发明的HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法简便有效，特别适用于分析人工培养蛹虫草子实体和其固体培养残基中的主要有效成分，即腺苷和虫草素，有效控制其产品质量，本发明的方法为通过大量实验所得到的切实可行的科学方法，具有很好的重复性和稳定性，在实际应用中具有使用方便，快速、准确的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明实施例1的提取液中乙醇浓度对测得的腺苷和虫草素含量的影响； 图2为本发明实施例1中虫草素的标准曲线；
图3为本发明实施例1中腺苷的标准曲线；
图4和图5为应用本发明实施例1的方法对一个未知蛹虫草样品子实体和其固体培养残基测定的色谱图，其中图4为蛹虫草子实体样品的色谱图，图5为蛹虫草固体培养残基样品的色谱图。
【具体实施方式】
[0013]下方结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
[0014]以下实施例中所用仪器和试剂为:
仪器:Waters e2695型高效液相色谱仪；Waters 2489紫外可见光检测器；millinium工作站及empowerf数据处理系统(美国Waters公司)；ΚΗ_700Ε型超声波清洗器；Milli_Q超纯水制备及分配仪；
供试品:蛹虫草子实体及其固体培养残基(上海交通大学农业与生物学院虫草课题组培植)；
试剂:腺苷标准品(纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司)；虫草素标准品(纯度>98%，上海融禾医药科技有限公司)；无水甲醇(JTBaker化工产品贸易有限公司)，色谱纯；无水乙醇(中九科技有限公司)，分析纯；超纯水(经Mill1-Q超纯水制备及分配仪制备)；其它试剂均为分析纯。
[0015]实施例1
本实施例中测试所用色谱条件为:色谱柱:由waters公司提供的XBridgeTM C18(5μ m, 4.6 X 150 mm)；流动相:甲醇:水的体积比为10:90 ；
检测波长:254nm ；
流速:1.0ml/min ；
柱温:30 V
进样量:10 uL(自动进样)。
[0016]本实施例中HPLC法分析蛹虫草子实体和固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法包括如下步骤:
第一步、腺苷和虫草素标准溶液的制备和蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制
备
腺苷和虫草素标准溶液制备:精确称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品各4mg，准确到0.0OOl g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作为标准储备液，浓度记为80 μ g/ml ；然后将所述标准储备液用超纯水稀释成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和虫草素标准溶液；
蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备:将蛹虫草子实体置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 °C,5000 r/min的离心机中离心15 min,吸取上清液I ml,经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤；将蛹虫草固体培养残基置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草固体培养残基粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 0C >5000 r/min的离心机中离心15 min，吸取上清液I ml，经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤；
第二步、分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草子实体供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草子实体供试溶液应呈现与腺苷和虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草固体培养残基供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草固体培养残基供试溶液应呈现与腺苷虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；测试的色谱条件如下:色谱柱为XBridgeTM C18(5 μ m, 4.6 x 150mm);流动相:甲醇、超纯水,体积比为10:90 ;流速:1.0 ml/min ;进样量:10 μ I,自动进样；柱温:30 V ;检测波长:254 nm。
[0017]本实施例中首先对影响提取结果的因素进行了优化，确定了最优提取和测定条件，并对本实施例的方法的精密度和灵敏度进行了评估。
[0018]首先对蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备过程中提取液的组成和比例进行了优化选取，具体为:选取乙醇和/或水作为提取液，其中乙醇浓度分别为O %、20%、40 %、60 %、80 %> 100 %，不同提取液系统得到的同一样品中腺苷和虫草素含量结果见图1，由图可知，所测样 品中腺苷和虫草素的含量均随着提取液中乙醇浓度的增大而明显降低，当乙醇浓度为100 %时，腺苷和虫草素含量极低，而当提取液为纯水时，两者的提取含量均为最高，因此，本发明优选水为提取液。
[0019]其次，采用上述类似的方法对蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备过程中提取时间及温度的优化选择，结果发现:
当提取时间少于30 min时，所测腺苷含量随提取时间的增加有较明显的提高，当提取时间为40 min时，所测腺苷含量达到最大，为192.87 mg/100g ;随提取温度升高，所测腺苷含量有下降趋势，这可能由于腺苷分子中羟基较多，在温度较高的条件下，腺苷分子内或分子间易形成氢键，导致分子结构发生变化所致。总体观察发现，提取时间及温度对所测虫草素的影响均不大，并根据以上相关实验结果，最终确定40 min为最佳时间，25°C为最佳提取温度。
[0020]再次，采用上述类似的方法对蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备过程中超声功率及提取次数进行了优选，结果发现:超声功率改变对虫草素的含量影响较小，但随超声功率的提闻，腺昔含量略有提闻，因此，本实验优选实验仪器所能达到的最大超声功率，此处为500 W ;而提取次数对虫草素和腺苷的影响较小，本实验结果表明:用水提取I次，提取40 min即可将腺苷和虫草素提取完全，提取2次仅使腺苷和虫草素分别增加了
0.044 %，2.32 %，因此一次提取即可满足分析要求，优选提取次数为一次。
[0021]此外，发明人还对本实施例方法的测试精密度进行了评估，方法如下:
质量浓度为20 μ g/ml的腺苷和虫草素标准溶液，过0.45 μ m微孔滤膜后注入进样瓶并编号；连续进样6次进行测试，计算得腺苷和虫草素的RSD (relative standarddeviation (相对标准偏差))值分别为0.559 %、0.433 %，均小于2.0 %，证明采用本实验方法对腺苷和虫草素进行一次性定量分析时，重现性好，结果可靠。
[0022]发明人还做了空白回收率实验对本实施例方法的测试灵敏度进行了评估，具体如下:
取质量浓度为20 μ g/ml的腺苷和虫草素标准溶液，过0.45 μ m微孔滤膜后注入进样瓶中，连续进样3次，以标准曲线定量。测得腺苷和虫草素的空白回收率平均值分别为99.06 %、99.11 %，说明色谱系统检测灵敏度高，稳定性好。
[0023]发明人还做了加标回收`率实验以确定本实施例方法的加标回收效果，具体如下: 分别称取蛹虫草子实体、固体培养残基干燥粉末0.25 g，分别放至50 mL具塞离心管
中，分别加入15 mL超纯水，塞紧，分别超声提取40 min，分别过滤至25 mL容量瓶中，分别加入2.5 mL、1.25mL 80ppm腺苷和虫草素标准溶液,定容至25mL,分别过0.45 μ m微孔滤膜后分别注入进样瓶中，编号，进样分析，结果见下表:
子实体中腺苷回收率为91.92 %~95.82 %，平均回收率为93.67 %，RSD为2.1 % ;虫草素回收率为88.28 %~92.43 %，平均回收率为90.57 %，RSD为2.3 %。
[0024]固体培养残基中腺苷回收率89.50 %~95.75 %，平均回收率为92.18 %, RSD为3.5% ;虫草素回收率为94.65 %~95.20 %，平均回收率为94.86 %，RSD为2.3 %。
[0025]以上结果说明该实验方法加标回收效果较好，可用于蛹虫草子实体和固体培养残基中腺苷和虫草素的含量测定。
[0026]此外，发明人还对本实施例方法的供试溶液稳定性进行了实验，具体为:采用上述优化后的提取方法对某一样品进行前处理，将提取得到的上清液分别在室温下放置不同时间(O h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h),然后分别测定不同时间放置后的样品中腺苷和虫草素的含量。实验发现:在24 h内，采用本实验提取条件提取的溶液，其腺苷和虫草素的含量保持相对稳定，腺苷和虫草素七次实验的RSD值分别为4.61 %和0.56 %。
[0027]在蛹虫草子实体和固体培养残基中腺苷和虫草素含量在色谱柱中进行测试时，首先做出腺苷、虫草素含量的标准曲线，方法如下:取配好的6个不同浓度的腺苷和虫草素标准溶液(2 μ g/ml>5 μ g/ml> 10 μ g/ml>20 μ g/ml>40 μ g/ml>80 μ g/ml)润旋振荡充分混匀，用0.45μπι水相微孔滤膜过滤后直接注入进样瓶。每个进样重复3次，以浓度(yg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，作出测定腺苷、虫草素含量的标准曲线，结果见图2和图3。
[0028]采用本实施例优化后的方法对两个未知供试样品的虫草素和腺苷含量进行了测定，具体如下:
采用优化后的提取条件对某一人工培养的蛹虫草样品进行前处理，具体处理步骤及液相条件参照前面所述优选条件。分别测定蛹虫草子实体和固体培养残基中腺苷、虫草素含量。测试方法为:吸取处理好的样品供试溶液I ml，经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤后注入进样瓶中。所得子实体中腺苷和虫草素含量和固体培养残基中腺苷和虫草素含量的液相色谱图分别如图4和图5所示。其中，子实体中腺苷和虫草素的含量分别为52.993 mg/100g,10.189 mg/100g，平行处理3次，RSD值分别为2.087 %、1.131 % ;固体培养残基中腺苷和虫草素的含量分别为7.013 mg/100g, 19.340 mg/100g，平行处理3次，RSD值分别为6.78%、5.65 %。
[0029]本发明确立了一种高效液相色谱法一次进样同时测定蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素的方法，并对样品提取条件进行了较全面的优化。该方法主要有以下优点:
1)样品前处理简单，经水超声，一次性提取即可；
2)回收率高、稳定性好。子实体中腺苷和虫草素的加标回收率分别为93.67 %、90.57%，重复测定的RSD分别为2.1 %、2.3 %(n=3);固体培养残基中腺苷和虫草素的加标回收率分别为92.18 %、91.62 %，重复测定的RSD分别为3.5 %、3.0 %(n=3)；
3)较已报道的分析方法，简化了流动相的组成，尤其避免了缓冲盐的使用对仪器的损伤，以甲醇和水为流动相等度洗脱，分析过程极其简便。
[0030]这为今后蛹虫草子实体中腺苷和虫草素的分析提供了参考依据。
[0031]以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的【具体实施方式】。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属【技术领域】技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
【权利要求】
1.一种HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)腺苷和虫草素标准溶液的制备和蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备； 腺苷和虫草素标准溶液制备:称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品置于容器中，用水溶解并定容作为标准储备液，加超纯水将所述标准储备液稀释成若干不同浓度的腺苷和虫草素标准溶液； 分别制备蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液:将蛹虫草子实体烘干，经粉碎机粉碎后过筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末样品，加入提取液进行提取，提取结束后分离得上清液，即为蛹虫草子实体供试溶液；将蛹虫草固体培养残基烘干，经粉碎机粉碎后过筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草固体培养残基粉末样品，加入提取液进行提取，提取结束后分离得上清液，即为蛹虫草固体培养残基供试溶液； (2)分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草子实体供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草子实体供试溶液应呈现与腺苷和虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草固体培养残基供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草固体培养残基供试溶液应呈现与腺苷虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；测试的色谱条件如下:色谱柱为XBridgeTM C18(5 μ m, 4.6 x 150 mm);流动相:甲醇、超纯水，体积比为10:90 ;流速:1.0 ml/min ;进样量:10 μ L,自动进样；柱温:30 V ;检测波长:254 nm。
2.如权利要求1所述的HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述腺苷和虫草素标准溶液制备方法为:精确称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品各4mg，准确到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作为标准储备液，浓度记为80 μ g/ml ;然后将所述标准储备液用超纯水稀释成2 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml>20 μ g/ml、40 μ g/ml、80 μ g/ml的腺苷和虫草素标准溶液。
3.如权利要求1所述的HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述蛹虫草子实体及其残基供试溶液制备方法为:将蛹虫草子实体置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 0C >5000 r/min的离心机中离心15 min，吸取上清液I ml，经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤；将蛹虫草固体培养残基置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草固体培养残基粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，加入25ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 5000 r/min的离心机中离心15min,吸取上清液I ml,经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤。
4.如权利要求3所述的HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述提取液为水。
5.如权利要求4所述的HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述超声提取在25°C条件下提取40分钟，提取一次。
6.—种HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法,其特征在于，包括以下步骤: (I)腺苷和虫草素标准溶液的制备和蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备；腺苷和虫草素标准溶液制备:精确称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品各4mg，准确到0.0OOl g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作为标准储备液，浓度记为80 μ g/ml ；然后将所述标准储备液用超纯水稀释成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和虫草素标准溶液； 蛹虫草子实体及其固体培养残基供试溶液制备:将蛹虫草子实体置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末样品0.25 g于50ml离心管中，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 °C,5000 r/min的离心机中离心15 min,吸取上清液I ml,经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤；将蛹虫草固体培养残基置于40 °C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草固体培养残基粉末样品0.25 g于50 ml离心管中，加入25 ml提取液进行超声提取，提取结束后将离心管置于20 0C >5000 r/min的离心机中离心15 min，吸取上清液I ml，经0.45 μ m水相微孔滤膜过滤； (2)分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草子实体供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草子实体供试溶液应呈现与腺苷和虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；分别精密吸取腺苷和虫草素标准溶液及蛹虫草固体培养残基供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草固体培养残基供试溶液应呈现与腺苷虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰；测试的色谱条件如下:色谱柱为XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流动相:甲醇、超纯水，体积比为10:90 ;流速:1.0 ml/min ;进样量:10 μ L,自动进样；柱温:30 V ;检测波长:254 nm。
7.如权利要求6所述的HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述提取液为水。
8.如权利要求7所述的HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述超声提取在25°C条件下提取40分钟，提取一次。
【文档编号】G01N30/02GK103512975SQ201310424244
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】周培, 支月娥, 乐昕, 詹学佳 申请人:上海交通大学