同时检测微生物降解体系中氯氰菊酯及3-pba的方法
【专利摘要】本发明涉及一种农药及其降解中间产物的分析方法，属于生物【技术领域】。采用HPLC法同时测定微生物降解体系中氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的含量，通过对目标物紫外光全波段扫描、流动相的选择确定了最优检测条件：色谱柱Gemini100?C18，流动相为乙腈和pH2.5的磷酸水溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样体积10μL,梯度洗脱程序为：0-10min，乙腈:磷酸水=45:55（v/v）；10-18min，乙腈:磷酸水=85:15（v/v），于紫外波长210nm处检测。该方法具有前处理简单、灵敏度高、分析快速等优点,不仅主要适宜于微生物降解体系的分析，还可适宜于土壤、农产品等样品。
【专利说明】同时检测微生物降解体系中氯氰菊酯及3-PBA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及采用HPLC法同时检测微生物降解体系中氯氰菊酯及其中间产物一3-苯氧基苯甲酸。
【背景技术】
[0002]氯氰菊酯(Cypermethrin, C44H38Cl4N2O6, CY)是农业生产中使用较为广泛的一种拟除虫菊酯类农药，对光热稳定、疏水性强，自然降解速率慢，导致其在环境中的大量残留，并且发现其对人体神经、免疫和生殖系统均具有毒性。不仅如此，其降解产生的主要中间产物3-苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoic acid, C13H9O3, 3-PBA)也具有一定的生殖毒性，且较氯氰菊酯疏水性弱，半衰期更长(180d)，更易在环境中迁移和蓄积，造成农产品的二次污染，并且阻断拟除虫菊酯类农药的彻底降解。因此，彻底降解环境和农产品中的氯氰菊酯是当前亟待解决的难题。
[0003]微生物降解是一种高效和绿色的消除环境中农药及其降解中间产物污染的手段。近年来，国内外不少研究者已从不同生态环境筛选到了氯氰菊酯降解菌，它们大多以共代谢的方式降解氯氰菊酯并产生3-PBA。因此在菌株筛选时不能仅以氯氰菊酯降解率作为判断降解效果的标准，应同时监测3-PBA是否产生并降解。简单、准确并能同时监测氯氰菊酯降解和3-PBA产生的检测方法是获得理想氯氰菊酯降解菌和进一步研究菌株降解特性的基础，具有重要的实用价值。
[0004]高效液相色谱(HPLC)法具有高效、高灵敏度、高自动化的优点，样品前处理较简单。目前氯氰菊酯和3-PBA的同时检测多集中于土壤、尿液和血液样品分析方面，检测方法以气相色谱(GC)法和气相色谱-质谱(GC-MS)法为主。这些方法虽灵敏度高、检测准确，但样品前处理过程相对复杂、分析相对耗时且成本较高。
[0005]本专利旨在针对微生物降解体系，建立一种简单、快速、准确的HPLC法同时检测微生物降解体系中的氯氰菊酯和3-PBA含量，为筛选理想的氯氰菊酯降解菌、监测3-PBA产生及其进一步研究提供方法参考。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种微生物降解体系中氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的高效液相色谱分析方法。
[0007]为实现上述目的，本发明的氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的同时检测方法，包括如下步骤。
[0008](I)将氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸用有机溶剂溶解并定容。
[0009](2)色谱柱为C18柱，以(I)中的有机溶剂和水为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL/min,柱温30°C,进样体积10 μ L,于紫外波长208nm_211 nm处检测。
[0010]本发明用步骤(I)中的有机溶剂即乙腈分别溶解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的对照品，制成质量浓度分别约为ΙΟΟΟμ g/mL的标准溶液，再移取氯氰菊酯和3-PBA标准溶液各1.0 mL，定容至10 mL，得两者质量浓度均为100 μ g/mL的混合标准溶液。
[0011]本发明在200nm-400nm的波长范围内对上述两种标准溶液(氯氰菊酯和3-PBA)进行紫外光全波长扫描，得到紫外吸收曲线，最大吸收波长分别为208.6nm和211.0nm,氯氰菊酯和3-PBA在检测波长为210nm处有较好的吸收，杂质影响最小且流动相无吸收，因此选择210nm为检测波长。
[0012]本发明利用上述有机溶剂和水、磷酸水(pH 2.5)、甲酸水(pH 2.5)以不同的体积比考察色谱柱对氯氰菊酯和3-PBA分离的影响，得出乙腈-磷酸水溶液洗脱峰型良好且基线平稳，考察乙腈与不同PH的磷酸水溶液(pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0)对氯氰菊酯和3-PBA分离的影响，最后得出本发明的最优方案，所述流动相为乙腈和磷酸水(pH2.5)，梯度洗脱程序为:O -10 min,乙腈:磷酸水=45:55 (v/v) ；10 -18 min,乙腈:磷酸水=85:15 (v/v)。
[0013]本发明利用上述标准溶液，用步骤⑴中有机溶剂稀释，得到不同浓度的标准溶液，每个浓度标准溶液进样3次，以质量浓度X ( μ g/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。
[0014]本发明对氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸质量浓度均为10.0 μ g/mL的标准溶液连续进样5次，测得氯氰菊酯吸收峰面积分别为686541、692256、683602、686312和699713，相对标准偏差(RSD)为0.93%, 3-PBA吸收峰面积分别为969337、975750、990436、985712和997614，相对标准偏差(RSD)为1.15%，表明实验精密度高。
[0015]本发明提供的同时检测氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的高效液相色谱的最优检测条件为:色谱柱Gemini IOOA C18，流动相为乙腈和pH 2.5的磷酸水溶液，流速1.0mL/min，柱温30°C,进样体积IOyL,梯度洗脱程序为:0 -10 min,乙腈:磷酸水=45:55 (v/v) ；10-18 min,乙腈:磷酸水=85:15 (v/v),紫外波长210 nm。
[0016]本发明采用高效液相色谱法同时检测氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸，对样品无严格要求，此法主要适宜于微生物降解体系，但也可适宜于土壤、农产品等，样品只需经过适当的溶剂提取、浓缩和净化前处理即可。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为氯氰菊酯㈧和3-苯氧基苯甲酸⑶的紫外吸收曲线。
[0018]图2为氯氰菊酯(2)和3-苯氧基苯甲酸(I)标样的液相色谱图。
[0019]图3为氯氰菊酯标准曲线。
[0020]图4为3-苯氧基苯甲酸标准曲线。
[0021]图5为同时检测氯氰菊酯(2)和3-苯氧基苯甲酸⑴样品溶液的液相色谱图。【具体实施方式】
[0022]实例1:高效液相色谱法同时分析微生物降解体系中的氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸。
[0023]Luria-Bertani 培养基(LB):酵母浸膏(Yeast extract) 5.0g;氯化钠(Sodiumchloride)10g;胰蛋白胨(Casein tryptone) 10g;蒸懼水(H2O)IOOOmL;调 pH 至 7.0。此固体培养基在液体培养基中再加20g/L琼脂(Agar)，121°C，灭菌20min。
[0024]样品制备:将地衣芽孢杆菌BI {Bacillus Iicheniformis,登录号:HQ009796,一株氯氰菊酯共代谢菌)接种于30 mL含有氯氰菊酯质量浓度为100 μ g/mL的LB培养基中，180171^11振荡培养5(1，得到发酵液，取均匀发酵液1.0 mL，加入乙腈1.0 mL后超声(40kHz, 300 w)辅助提取30 min，再用乙腈定容至10.0 mL，取2.0 mL定容后的样品于12000r/min离心10 min,将上清液用0.45 μ m的有机相滤膜过滤后得滤液,用于液相色谱分析。
[0025]用[0015]的检测方法对氯氰菊酯和3-PBA含量进行测定，结果显示，氯氰菊酯的残留质量浓度为44.9 μ g/mL，3-PBA质量浓度为8.79 μ g/mL。
[0026]实例2:高效液相色谱法同时分析土壤中的氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸。
[0027]从常年使用拟除虫菊酯农药的蔬菜田地的土壤中取一定量的土壤样品，添加氯氰菊酯使其质量浓度约为50 μ g/g，接种菌株B1，30°C培养5d。
[0028]称取土壤样品10.0g，置250mL三角瓶中，加乙腈50mL，振荡(180r/min)提取lh，移取IOmL提取液至离心管中，12000r/min离心lOmin，将上清液用0.45 μπι的有机相滤膜过滤后得滤液，用于液相色谱分析。
[0029]用[0015]的检测方法对氯氰菊酯和3-ΡΒΑ含量进行测定，结果显示，土壤样品中氯氰菊酯的残留质量浓度为32.3 μ g/g, 3-PBA质量浓度为4.2 μ g/g。
[0030]实例3:高效液相色谱法同时分析小白菜中的氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸。
[0031]随机选取市场所售的小白菜，喷洒质量浓度约为20 μ g/mL氯氰菊酯使小白菜表面带有农药，再喷洒BI菌悬液(菌体浓度不低于108cfu/mL)，30°C培养2d。
[0032]称取小白菜10.0g捣碎，置于三角瓶中，加入50mL乙酸乙酯和10.0g无水硫酸钠剧烈振摇以除去水分，超声(40 kHz, 300 w)辅助提取30 min，抽滤上清液，残渣用少量乙酸乙酯重复提取2次，再次抽滤，合并滤液用旋转蒸发仪挥发至干，用IOmL乙腈溶解，12000r/min离心IOmin,将上清液用0.45 μ m的有机相滤膜过滤后得滤液,用于液相色谱分析。
[0033]用[0015]的检测方法对氯氰菊酯和3-PBA含量进行测定，样品中氯氰菊酯的残留质量浓度为12.1 μ g/g, 3-PBA质量浓度为3.2 μ g/g。
[0034]以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行了简单描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的普通技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。
【权利要求】
1.采用高效液相色谱(HPLC)法同时检测微生物降解体系中氯氰菊酯及其中间产物一3-苯氧基苯甲酸的含量，其特征在于包括如下步骤: (1)将氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸用有机溶剂溶解并定容 (2)色谱柱为C18柱，以⑴中有机溶剂和水为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温30°C，进样体积10 μ L，于紫外波长208nm-211 nm处检测。
2.根据权利要求1所述的HPLC同时检测氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的分析方法，其特征在于:所述步骤(I)中的有机溶剂为乙腈。
3.根据权利要求1所述的HPLC同时检测氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的分析方法，其特征在于:所述步骤(2)中的流动相为色谱纯乙腈和pH2.5磷酸水。
4.根据权利要求1所述的HPLC同时检测氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的分析方法，其特征在于:所述步骤(2)中的梯度洗脱为:O -10 min,乙月青:磷酸水=45:55(v/v);10 -18min,乙腈:磷酸水=85:15 (v/v)。
5.根据权利要求1所述的HPLC同时检测氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的分析方法，其特征在于:主要适宜于微生物降解体系，但也可适宜于土壤、农产品等，样品只需经过适当的溶剂提取、浓缩和净化前处理即可。
【文档编号】G01N30/88GK103776943SQ201310437458
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】不公告发明人 申请人:四川农业大学