一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法
【专利摘要】一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法，属于电化学免疫分析【技术领域】。将纳米材料超声分散于壳聚糖溶液制备纳米材料/壳聚糖复合物，利用该纳米复合物修饰玻碳电极固定牛细胞因子抗体，获得新颖的牛细胞因子免疫传感器，然后将其应用于牛细胞因子的电化学无标记阻抗免疫检测。该检测方法无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断及牛细胞免疫机理的研究。
【专利说明】—种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于电化学免疫分析【技术领域】，特别涉及牛细胞因子的免疫检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]结核病是对奶牛健康和产乳品质影响最为严重的传染疾病之一。Y-干扰素(IFN-Y)是在特定诱生剂刺激作用下，由T细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白，是发现最早、关注最多的细胞因子。白细胞介素_4 (IL-4)于20世纪80年代被发现，是由Th2型细胞分泌的一种多效性T细胞活化因子，是有机体体液免疫应答的重要调节因子。在结核感染早期，牛机体内IFN-Y和IL-4分泌水平显著提高。若以结核分枝杆菌特异抗原刺激潜伏感染期间的牛免疫记忆细胞，也会产生高水平的IFN-Y和IL-4。因此，牛IFN-Y和IL-4可以作为牛结核分枝杆菌感染的早期诊断的检测指标，对牛结核病的控制具有重要意义。
[0003]目前，生物学分析是常用的牛IFN-Y和IL-4检测方法，这些生物学分析方法灵敏度低，费力、耗时、且难于标准化。另外，它们对检测样品中的缓冲剂和其它细胞因子敏感，容易受到干扰。虽酶联免疫吸附分析也被建立来检测牛IFN-Y和IL-4，但是这些方法同样操作繁琐，费力、耗时，并且灵敏度也不能令人满意。由于牛IEN-Y和IL-4分子量较小且在机体体液中的量极少，所以目前测定牛IEN-Y和IL-4的方法的灵敏度距离临床实际应用还有较大差距。因此，当前急需建立一种超高灵敏度、快速、可靠的方法检测牛的IFN- Y、IL-4，为牛结核病的早期诊断提供一个平台。
[0004]近年来，电化学阻抗免疫分析法由于其无需标记，灵敏度高，特异性好，样品消耗量小、简单快速等特点，成为一种极有竞争力的现场检测方法。纳米材料具有独特化学、物理和机械性能的纳米材料，为电化学免疫分析研究提供了新研究途径。因此，利用纳米材料固定牛细胞因子抗体，建立一个电化学无标记组抗型免疫分析法检测牛细胞因子，对牛结核病的早期诊断具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述牛细胞因子检测方法的缺陷，建立一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法。
[0006]本发明的技术方案包括以下步骤；
1)将纳米材料超声分散在壳聚糖醋酸溶液中，形成纳米材料和壳聚糖的复合物，然后再混入牛细胞因子抗体，形成纳米材料/壳聚糖/牛细胞因子抗体混合液；所述纳米材料为还原石墨烯、介孔二氧化硅纳米颗粒或棒状二氧化钛；
2)将纳米材料/壳聚糖/牛细胞因子抗体混合液滴涂于洁净的玻碳电极表面，晾干后，再经牛血清蛋白封闭活性位点后，制得具有牛细胞因子免疫传感器的玻碳电极材料；
3)将具有牛细胞因子免疫传感器的玻碳电极材料置于含有37°C的牛细胞因子样品体系中，温育40分钟后以蒸溜水冲洗，制得牛细胞因子免疫传感器；
4)将制得的牛细胞因子免疫传感器置于已知的含有牛细胞因子的缓冲液中，在37°C条件下温育40 min后，取出温育后的牛细胞因子免疫传感器，以蒸馏水冲洗；
5)以蒸馏水冲洗后的牛细胞因子免疫传感器为工作电极、饱和甘汞电极作为辅助电极、钼片电极作为对电极，进行交流阻抗实验，制得同一种牛细胞因子和不同浓度的该牛细胞因子的交流阻抗谱图；
6)从各交流阻抗谱图中取得各谱图的直径，然后制成牛细胞因子浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图；
7)将牛细胞因子免疫传感器置于待测样品的缓冲液中，在37°C条件下温育40min后，取出温育后的牛细胞因子免疫传感器，以蒸馏水冲洗；然后以与步骤5)相同的条件进行交流阻抗实验，取得牛细胞因子的交流阻抗谱图，然后读取谱图的直径值；
8)在步骤6)取得的线性关系图中查找步骤7)取得的谱图的直径值所对应的值，即待测样品的牛细胞因子浓度的对数值。
[0007]以上步骤I)至6)是制作牛细胞因子浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图，步骤7)则是对待测样品的阻抗前后相对变化值检测，通过线性关系图可直接取得待测样品的牛细胞因子浓度的对数值。本发明以壳聚糖为制作传感器的成膜剂，利用具有比表面积较大的纳米材料来固定牛细胞因子抗体，以提高分析效果。该免疫传感器可用于牛干扰素-Y、白介素-4等细胞因子的定量检测。
[0008]本发明具有以下优点:
(I)该分析方法无需任何标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断及牛细胞免疫机理的研究。
[0009](2)纳米材料具有比表面积大，良好的生物相容性,利用其固定细胞因子抗体,有利于保持抗体的生物活性，拓宽检测的线性范围，提高免疫应特异性和反应效率，减少非特异性吸附，提高检测灵敏度。
[0010](3)壳聚糖是天然高分子聚合物甲壳素的脱乙酰基产物，它具有良好的成膜性和支持能力，并且生物相容性好，常用于生物材料的固定基质，表现出显著的生理活性和生物可降解性。
[0011]另外，本发明在将纳米材料超声分散在壳聚糖醋酸溶液中时，所述壳聚糖醋酸溶液中的壳聚糖质量百分比为1%，所述纳米材料与壳聚糖醋酸溶液的投料比为2mg:lmL。可使纳米材料均匀的分散在壳聚糖醋酸溶液中，以便更好的固定抗体。
[0012]以牛血清蛋白封闭活性位点的具体方法是:将晾干后的玻碳电极插置于常温的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min。
[0013]为了排除电极表面杂质对测定的影响，在所述滴涂纳米材料/壳聚糖/牛细胞因子抗体混合液之前，将玻碳电极用0.05 _的氧化铝粉抛光，再用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，然后放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面，取得洁净的玻碳电极。
[0014]所述稀硝酸溶液是由硝酸和水以体积比为1:1的比例混合形成的硝酸溶液。由于硝酸具有强氧化性，能够去除电极表面顽固的杂质。
[0015]所述交流阻抗实验的试液由体积比为1:1的铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合物5mM、0.1 M磷酸盐缓冲溶液和0.1 M氯化钾溶液组成。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为实施例1中将制备的牛IFN- Y免疫传感器加入到不同浓度牛IFN- Y后得到的交流阻抗谱图。
[0017]图2为从图1制得的牛IFN- Y浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图。
【具体实施方式】
[0018]下面对本发明的实验过程进行详细的说明，旨在使本发明的设计流程、设计目的及其创新点和优点更加清楚。
[0019]实施例1:
一、制作牛IFN-Y浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图:
(I)采用化学分散法制备还原石墨烯纳米材料:取氧化石墨0.1g与IOOmL蒸馏水混合，超声振荡30 min。之后将振荡分散好的氧化石墨加入到三颈瓶中，并加入Ig硼氢化钠，在100°C下加热回流8h。静置过滤，自然晾干后收集生成的即为还原石墨烯。
[0020](2)制备还原石墨烯/壳聚糖/牛IFN- Y抗体的混合液:将2mg还原石墨烯超声分散于ImL的壳聚糖质量百分比为1%的壳聚糖醋酸溶液中，形成还原石墨烯/壳聚糖的复合物。
[0021]然后向以上复合物中加入牛IFN-Y抗体40(^g/mL，搅拌混合均匀，形成还原石墨烯/壳聚糖/牛IFN- Y抗体的混合液。`
[0022](3)清洁玻碳电极材料:将玻碳电极用0.05mm的氧化铝粉抛光，用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面。
[0023](4)取还原石墨烯/壳聚糖/牛IFN- Y抗体混合液滴涂于洁净的玻碳电极表面，电极晾干后放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min,以封闭非特异性位点，制得牛IFN-Y免疫传感器。
[0024](5)将制得的牛IFN-Y免疫传感器分别置于由缓冲溶液稀释成的不同的浓度的牛IFN-Y缓冲溶液中，然后分别在37°C温育40 min，蒸馏水冲洗后，分别检测其电化学阻
抗信号。
[0025](6)交流阻抗实验在Autolab电化学工作站上进行，交流阻抗测定的频率范围是10—1 Hz到IO5 Hz，使用开路电位，正弦波电位的振幅为10 mV，阻抗测试液为含有5 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾(体积比为1:1进行混合制成)的0.1 M磷酸盐缓冲溶液和0.1 M氯化钾溶液。
[0026]以蒸馏水冲洗后的各个牛IFN-Y免疫传感器为工作电极、饱和甘汞电极作为辅助电极、钼片电极作为对电极，分别进行交流阻抗实验，制得牛IFN-Y免疫传感器和不同浓度的牛IFN-Y的交流阻抗谱图，如图1所示。图1中，Zre为实轴，Zim为虚轴。
[0027](7)从各交流阻抗谱图中取得各谱图的直径，然后制成牛IFN-Y浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图，如图2所示。图2中logCB()IFN_Y为牛干扰素- Y浓度的对数图，ARrf (ο/ο)为阻抗前后相对变化值。
[0028]二、对样品进行牛IFN-Y浓度的对数值检测:
(I)将以上步骤(4)制成的牛IFN-Y免疫传感器置于待测样品的缓冲液中，在37°C条件下温育40 min后，取出温育后的牛IFN-Y免疫传感器，以蒸馏水冲洗。
[0029](2)以与以上步骤(6)相同的条件进行交流阻抗实验，取得牛IFN-Y的交流阻抗谱图，然后取得谱图的直径值。
[0030](3)在步骤(7)取得的线性关系图中查找待测样品的谱图的直径值所对应的值，SP待测样品的牛IFN-Y浓度的对数值。
[0031]实施例2:
一、制作牛IL-4浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图:
(I)棒状二氧化钛的合成:在冰水浴条件下，将1.8 mL的四氯化钛缓慢加入到盛有19mL蒸懼水的50 mL烧杯中，剧烈搅拌10 min,得到白色悬池液。将15 mL氯仿溶剂加入到此悬浊液中，磁力搅拌10 min,再转移至聚四氟乙烯反应釜中，置于160°C的烘箱中，水热反应12 h。将所得产物用无水乙醇离心洗涤至中性后，置于60°C真空箱中烘干24 h，室温下研磨得到产物。
[0032](2)制备二氧化钛/壳聚糖/牛IL-4抗体的混合液:将2 mg 二氧化钛纳米棒超声分散于I mL的I %壳聚糖醋酸溶液中，然后加入牛IL-4抗体，搅拌混合均匀，形成二氧化钛/壳聚糖/牛IL-4抗体的混合液。
[0033](3)清洁玻碳电极材料:将玻碳电极用0.05 mm的氧化铝粉抛光，用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面。
[0034](4)取二氧化钛/壳聚糖/牛IL-4抗体混合液滴涂于洁净的玻碳电极表面，晾干后放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min，以封闭非特异性位点，制得牛IFN-Y免疫传感器。
[0035](5)将制得的牛IL-4免疫传感器分别置于由缓冲溶液稀释成的不同的浓度的牛IL-4缓冲溶液中，然后分别在37°C温育40 min，蒸馏水冲洗后，分别检测其电化学阻抗信号。
[0036](6)交流阻抗实验在Autolab电化学工作站上进行，交流阻抗测定的频率范围是10—1 Hz到IO5 Hz，使用开路电位，正弦波电位的振幅为10 mV，阻抗测试液为含有5 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾(1:1)的0.1 M磷酸盐缓冲溶液和0.1 M氯化钾溶液。
[0037]以蒸馏水冲洗后的各个牛IL-4免疫传感器为工作电极、饱和甘汞电极作为辅助电极、钼片电极作为对电极，分别进行交流阻抗实验，制得牛IL-4免疫传感器和不同浓度的牛IL-4的交流阻抗谱图。
[0038](7)从各交流阻抗谱图中取得各谱图的直径，然后制成牛IL-4浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图。
[0039]二、对样品进行牛IL-4浓度的对数值检测:
(I)将以上步骤(4)制成的牛IL-4免疫传感器置于待测样品的缓冲液中，在37°C条件下温育40 min后，取出温育后的牛IL-4免疫传感器，以蒸馏水冲洗。
[0040](2)以与以上步骤(6)相同的条件进行交流阻抗实验，取得牛IL-4的交流阻抗谱图，然后取得谱图的直径值。
[0041](3)在步骤(7)取得的线性关系图中查找待测样品的谱图的直径值所对应的值，SP待测样品的牛IL-4浓度的对数值。
[0042]实施例3:
一、制作牛IL-4浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图:
(I)介孔二氧化硅纳米颗粒的合成:称取IOg十六烷基三甲基溴化铵溶解在480 mL蒸馏水中，并加入氢氧化钠溶液(2.00 M, 3.50 mL)，保持溶液温度在80°C。将5 mL三乙氧基硅烷逐滴加入该溶液中，并在80°C条件下搅拌2 h，得到的白色沉淀物经过滤法分离。将分离得到的二氧化硅颗粒在550°C马沸炉中煅烧5 h得到最终产物。
[0043](2)制备二氧化硅/壳聚糖/牛IFN- Y抗体的混合液:将2 mg介孔二氧化硅超声分散于I mL的I %壳聚糖醋酸溶液中，然后加入牛IFN-Y抗体，搅拌混合均匀，形成二氧化硅/壳聚糖/牛IFN- Y抗体的混合液。
[0044](3)清洁玻碳电极材料:将玻碳电极用0.05 mm的氧化铝粉抛光，用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面。
[0045](4)取二氧化硅/壳聚糖/牛IFN- Y抗体混合液滴涂于洁净的玻碳电极表面，晾干后放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min,以封闭非特异性位点，制得牛IFN-Y免疫传感器。
[0046](5)将制得的牛IFN-Y免疫传感器分别置于由缓冲溶液稀释成的不同的浓度的牛IFN-Y缓冲溶液中，然后分别在37°C温育40 min，蒸馏水冲洗后，分别检测其电化学阻
抗信号。
[0047](6)交流阻抗实验在Autolab电化学工作站上进行，交流阻抗测定的频率范围是10—1 Hz到IO5 Hz，使用开路电位，正弦波电位的振幅为10 mV，阻抗测试液为含有5 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾(1:1)的0.1 M磷酸盐缓冲溶液和0.1 M氯化钾溶液。
[0048]以蒸馏水冲洗后的各个牛IFN-Y免疫传感器为工作电极、饱和甘汞电极作为辅助电极、钼片电极作为对电极，分别进行交流阻抗实验，制得牛IFN-Y免疫传感器和不同浓度的牛IL-4的交流阻抗谱图。
[0049](7)从各交流阻抗谱图中取得各谱图的直径，然后制成牛IFN-Y浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图。
[0050]二、对样品进行牛IFN-Y浓度的对数值检测:
(I)将以上步骤(4)制成的牛IFN-Y免疫传感器置于待测样品的缓冲液中，在37°C条件下温育40 min后，取出温育后的牛IFN-Y免疫传感器，以蒸馏水冲洗。
[0051](2)以与以上步骤(6)相同的条件进行交流阻抗实验，取得牛IFN-Y的交流阻抗谱图，然后取得谱图的直径值。
[0052](3)在步骤(7)取得的线性关系图中查找待测样品的谱图的直径值所对应的值，SP待测样品的牛IFN-Y浓度的对数值。
【权利要求】
1.一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤； 1)将纳米材料超声分散在壳聚糖醋酸溶液中，形成纳米材料和壳聚糖的复合物，然后再混入牛细胞因子抗体，形成纳米材料/壳聚糖/牛细胞因子抗体混合液；所述纳米材料为还原石墨烯、介孔二氧化硅纳米颗粒或棒状二氧化钛； 2)将纳米材料/壳聚糖/牛细胞因子抗体混合液滴涂于洁净的玻碳电极表面，晾干后，再经牛血清蛋白封闭活性位点后，制得具有牛细胞因子免疫传感器的玻碳电极材料； 3)将具有牛细胞因子免疫传感器的玻碳电极材料置于含有37°C的牛细胞因子样品体系中，温育40分钟后以蒸溜水冲洗，制得牛细胞因子免疫传感器； 4)将制得的牛细胞因子免疫传感器置于已知的含有牛细胞因子的缓冲液中，在37°C条件下温育40 min后，取出温育后的牛细胞因子免疫传感器，以蒸馏水冲洗； 5)以蒸馏水冲洗后的牛细胞因子免疫传感器为工作电极、饱和甘汞电极作为辅助电极、钼片电极作为对电极，进行交流阻抗实验，制得同一种牛细胞因子和不同浓度的该牛细胞因子的交流阻抗谱图； 6)从各交流阻抗谱图中取得各谱图的直径，然后制成牛细胞因子浓度的对数值与阻抗前后相对变化值的线性关系图； 7)将牛细胞因子免疫传感器置于待测样品的缓冲液中，在37°C条件下温育40min后，取出温育后的牛细胞因子免疫传感器，以蒸馏水冲洗；然后以与步骤5)相同的条件进行交流阻抗实验，取得牛细胞因子的交流阻抗谱图，然后读取谱图的直径值； 8)在步骤6)取得的线性关系图中查找步骤7)取得的谱图的直径值所对应的值，即待测样品的牛细胞因子浓度的对数值。
2.根据权利要求1所述的一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法，其特征在于在将纳米材料超声分散在壳聚糖醋酸溶液中时，所述壳聚糖醋酸溶液中的壳聚糖质量百分比为1%，所述纳米材料与壳聚糖醋酸溶液的投料比为2mg:lmL。
3.根据权利要求1所述的一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法，其特征在于以牛血清蛋白封闭活性位点的具体方法是:将晾干后的玻碳电极插置于常温的牛血清蛋白中，置于37°C水浴30 min。
4.根据权利要求1所述的一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法，其特征在于在所述滴涂纳米材料/壳聚糖/牛细胞因子抗体混合液之前，将玻碳电极用0.05 mm的氧化铝粉抛光，再用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，然后放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面，取得洁净的玻碳电极。
5.根据权利要求4所述的一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法，其特征在于所述稀硝酸溶液是由硝酸和水以体积比为1:1的比例混合形成的硝酸溶液。
6.根据权利要求4所述的一种牛细胞因子电化学无标记阻抗型免疫检测方法，其特征在于所述交流阻抗实验的试液由体积比为1:1的铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合物5 mM、0.1M磷酸盐缓冲溶液和0.1 M氯化钾溶液组成。
【文档编号】G01N33/68GK103472238SQ201310443715
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】杨占军, 赵洁, 陈祥 申请人:扬州大学