阻断KIF17-m Lin10-NR2B转运通路的试剂盒及制备方法
【专利摘要】本发明涉及阻断KIF17-m?Lin10-NR2B转运通路的试剂盒及制备方法。本发明包括KIF17、接头蛋白mLin10-PDZ1、接头蛋白mLin2、mLin7、NR2B、KIF17；其中，KIF17是始动单元，接头蛋白mLin10-PDZ1是第一连接单元，接头蛋白mLin2是第二连接单元，接头蛋白mLin7是第三连接单元，NR2B是被捆绑单元。本发明解决了单一或联合阻断其中的一条或几条通路并不能有效阻断NR2B在树突膜的表达上调的缺陷。本发明结构清楚，作用机制明确，能够较为完善的调制NR2B介导的痛觉过敏反应。与多数一般有机小分子药物相比，肽类药物试剂盒具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等突出特点；与蛋白类相比，小肽几乎没有免疫原性；可化学合成，产品纯度高，质量可控。
【专利说明】阻断KIF1 7-m L i n10-NR2B转运通路的试剂盒及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学领域，特别涉及阻断KIF17-m LinlO-NR2B转运通路的试剂盒及制
备方法。
【背景技术】
[0002]在本发明之前，在医学界对疼痛的研究表明，NR2B信号分子及其上下游各种蛋白激酶通路在疼痛的产生以及维持过程中发挥着重要作用，如EphBR-Src-NR2B通路、Cdk5-ERKl/2-NR2B 通路、NR2B_CaMKII 通路、NR2B-nN0S 通路、PKA-NR2B 通路、PKC-NR2B 通路等。研究表明这些通路间相互调控，共同形成了一个网络。单一或联合阻断其中的一条或几条通路并不能有效阻断NR2B在树突膜的表达上调，加上其特异性差，使得不良反应较大，治疗疼痛的效果也不十分理想。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制阻断KIF17-m LinlO_NR2B转运通路的试剂盒及制备方法。
[0004]本发明的技术方案是:
[0005]阻断KIF17-m LinlO-NR2B转运通路的试剂盒，其主要技术特征在于包括KIF17、接头蛋白mLinlO-PDZl、接头蛋白mLin2、mLin7、NR2B、KIF17 ;其中，KI F17是始动单元，接头蛋白mLinlO-PDZl是第一连接单元,接头蛋白mLin2是第二连接单元,接头蛋白mLin7是第三连接单元，NR2B是被捆绑单元；。
[0006]所述KIF17触发后与第一连接单元接头蛋白mLinlO-PDZl结合组成结合体,结合体进一步与第二连接单元接头蛋白mLin2及第三连接单元接头蛋白mLin7结合成更大的结合体，其中第三连接单元接头蛋白mLin7发生构型变化，与被捆绑单元NR2B紧密结合。
[0007]本发明的另一技术方案是:
[0008]阻断KIF17-m LinlO-NR2B转运通路的试剂盒制备方法，其步骤在于:
[0009](I)采用Trizol抽提疼痛模型大鼠尾静脉血清中的总RNA，再利用RT-PCR技术分别扩增包含KIF17、Mintl、NR2B cDNA的主要免疫表位多肽和截短多肽的基因片断；
[0010](2)将扩增的基因片断插入提取的正常大鼠细胞内；
[0011](3)利用数学模型筛选法和理性数据库筛选法，结合蛋白质和配体相互作用的MJ矩阵和隐马可夫模型的规则，为蛋白质KIF17筛选小肽抑制剂RC-13。
[0012](4)采用N1-NTA树脂层析纯化，最终获得高纯度的重组小肽，制备成阻断KIF17-mLinlO-NR2B转运通路的试剂盒。
[0013]本发明的有益效果是，结构清楚，作用机制明确，相对于之前单一通路的阻滞无法达到疼痛信号的网络式阻滞，能够较为完善的调制NR2B介导的痛觉过敏反应。与多数一般有机小分子药物相比，肽类药物试剂盒具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等突出特点；与蛋白类相比，小肽几乎没有免疫原性；可化学合成，产品纯度高，质量可控。
[0014]本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1——本发明的机制原理图。
[0016]图中各标号与名称之间对应关系如下:
[0017]NR2B(1)、mLin7(2)、mLin2(3)、mLinlO ⑷、钙 /钙调蛋白(5)、KI F17(6)、CaMKII (7)、微管(8)、PSD95 (9)、PDZl (10)。
【具体实施方式】
[0018]本发明的技术思路是:
[0019]一种驱动蛋白17竞争性小肽抑制剂RC-13，通过竞争性与Mintl-PDZl结构域结合，“抢占” KIF17尾部C-末端的作用位点，使驱动蛋白17尾部C-末端和衔接蛋白Mintl的特异性结合受到限制，影响神经元内含NR2B亚基的NMDA受体翻译后的正常转运过程，使得定位于突触后膜的NR2B量减少，疼痛信号的转导减弱。
[0020]下面是具体说明:
[0021]如图1所示，试剂盒包括KIF17(6)、接头蛋白mLinl0(4)-PDZl(10)、接头蛋白mLin2(3)、mLin7(2)、NR2B(1)KIF17(6)。
[0022]其中，KI F17(6)是始动单元；接头蛋白mLinlO (4)-PDZl (10)是第一连接单元；接头蛋白mLin2(3)是第二连接单元；mLin7 (2)是第三连接单元；NR2B (I) KIF17 (6)是捆绑单
J Li ο
[0023]试剂盒制备方法:
[0024]采用Trizol提取疼痛模型大鼠尾静脉200 μ I血清总RNA，用随机引物逆转录合成cDNA，采用巢式PCR扩增KIF17、Mintl、NR2B基因片断。PCR反应条件为:94°C-30秒，550C -30秒，72°C -60秒，35个循环。PCR产物经2.0 %琼脂糖凝胶电泳后检测到大小约639bp的条带。琼脂糖凝胶回收纯化是使用北京天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按照说明书操作即可。
[0025]通过T-A克隆原理，将纯化的PCR产物插入提取正常大鼠的细胞内，利用数学模型筛选法和理性数据库筛选法，结合蛋白质和配体相互作用的MJ矩阵和隐马可夫模型的规贝丨J，为蛋白质KIF17筛选小肽抑制剂RC-13。因此，获得的阻断KIF17-m LinlO-NR2B转运通路的试剂盒。
[0026]本发明的应用过程说明:
[0027]KIF17(6)的尾部和接头蛋白mLinlO (4)-PDZl (10)结构域结合，mLinlO (4)再依次结合接头蛋白1111^112(3)、1111^117(2)，1111^117(2)再与 NR2B(1)结合。装载了 NR2B(1)的KIF17(6)沿着微管(8)由负极向正极移动，到达树突末端的时候，KIF17(6)的丝氨酸1029被钙/钙调蛋白(5)依赖的CaMKII (7)磷酸化，释放出NR2B (I)，NR2B (I)在PSD95 0)的作用下被锚定到细胞膜上。箭头所示:此小肽主要作用是干扰KIF17(6)与mLinlO (4) -PDZl (10)结构域之间的作用。
[0028]竞争性小肽抑制剂RC-13，通过竞争性与Mintl-PDZl结构域结合，“抢占"KIF17尾部C-末端的作用位点，使驱动蛋白17尾部C-末端和衔接蛋白Mintl的特异性结合受到限制，影响神经元内含NR2B亚基的NMDA受体翻译后的正常转运过程，使得定位于突触后膜的NR2B量减少。
【权利要求】
1.阻断KIF17-mLinlO-NR2B转运通路的试剂盒，其特征在于包括KIF17、接头蛋白mLinlO-PDZl、接头蛋白mLin2、mLin7、NR2B、KIF17 ;其中，KIF17是始动单元，接头蛋白mLinlO-PDZl是第一连接单元,接头蛋白mLin2是第二连接单元,接头蛋白mLin7是第三连接单元，NR2B是被捆绑单元。
2.根据权利要求1所述的阻断KIF17-mLinlO-NR2B转运通路的试剂盒，其特征在于KIF17触发后与第一连接单元接头蛋白mLinlO-PDZl结合组成结合体,结合体进一步与第二连接单元接头蛋白mLin2及第三连接单元接头蛋白mLin7结合成更大的结合体,其中第三连接单元接头蛋白mLin7发生构型变化，与被捆绑单元NR2B紧密结合。
3.一种如权利要求1所述的阻断KIF17-m LinlO-NR2B转运通路的试剂盒制备方法，其步骤在于: (1)采用Trizol抽提疼痛模型大鼠尾静脉血清中的总RNA，再利用RT-PCR技术分别扩增包含KIF17、Mintl、NR2B cDNA的主要免疫表位多肽和截短多肽的基因片断； (2)将扩增的基因片断插入提取的正常大鼠细胞内； (3)利用数学模型筛选法和理性数据库筛选法，结合蛋白质和配体相互作用的MJ矩阵和隐马可夫模型的规则，为蛋白质KIF17筛选小肽抑制剂RC-13 ； (4)采用N1-NTA树脂层析纯化，最终获得高纯度的重组小肽，制备成阻断KIF17-mLinlO-NR2B转运通路的试剂盒。
【文档编号】G01N33/68GK103529219SQ201310472617
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】马正良, 顾小萍, 孙玉娥 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院