结直肠癌恶性程度及其转移的免疫组化诊断试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种结直肠癌恶性程度及其转移的免疫组化诊断试剂盒，该试剂盒包含：内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂，其特征在于所述的一抗为人源抗S100A8单克隆抗体或鼠源S100A8单克隆抗体，所述的二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。利用该试剂盒，通过检测结直肠病理组织表面S100A8抗原的表达，能快速准确地判断结直肠癌恶性程度及转移情况，为结直肠癌的临床诊断提供帮助。
【专利说明】结直肠癌恶性程度及其转移的免疫组化诊断试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤免疫诊断试剂盒，具体涉及用于结直肠癌免疫组化试剂盒。
【背景技术】
[0002]SlOO蛋白是由小分子量蛋白(10-14 kDa)组成的钙结合蛋白家族，因其在中性pH条件下能溶解于100%饱和度硫酸铵中而得名。研究发现，此类蛋白只在脊柱动物中表达，目前已发现23种SlOO蛋白家族成员。S100A8蛋白是SlOO蛋白家族的重要成员之一，具有SlOO蛋白家族特征性的保守EF手型结构和4-螺旋环形，通过与Ca2+、Zn2+及Cu2+等不同金属离子结合发生结构变异，暴露与靶蛋白的结合位点进而通过与相应的效应靶蛋白相互作用参与炎症反应、免疫反应及肿瘤发生发展等生物学效应。虽然国内外研究表明，S100A8在胃癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌中显著高表达，但对于S100A8蛋白与特定肿瘤发生发展的关系，以及其S100A8在特定肿瘤诊断治疗中的应用，尚缺少更深入的实验和研究。
[0003]结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常见的恶性肿瘤，据2008年国际癌症机构(IARC)研究统计，世界范围内每年约有一百万人发生结直肠癌，全球结直肠癌死亡率占肿瘤总死亡率8%，肿瘤致死率排名第四，且我国结直肠癌病死率高达45.5%,而结直肠肿瘤的恶性程度及侵袭转移的发生与肿瘤致死密切相关。因此，寻找一种快速判断结直肠癌恶性程度和远处转移的检测方法至关重要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种快速便捷地诊断结直肠癌恶性程度和远处转移的免疫组化检测试剂盒，用本发明的免疫组化试剂盒，检测结直肠病理组织表面S100A8抗原的表达，以此能快速准确地判断结直肠癌恶性程度及转移情况。
[0005]为达到上述发明目的，发明人提供一种诊断结直肠癌恶性程度和远处转移的免疫组化检测试剂盒，该试剂盒包含:内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂。所述的一抗为人源抗S100A8单克隆抗体或鼠源抗S100A8单克隆抗体，所述的二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
[0006]本发明中，常规各种用于免疫组化试验的内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、酶、显色剂均可用于本发明试验盒，但作为最佳选择，本发明中所述的内源性过氧化物酶阻断剂优选3 wt%H202，所述的非特异性结合位点阻断剂优选为非免疫羊血清，所述酶优选链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，所述显色剂优选DAB显色剂，包括:DAB缓冲液(20 X )，DAB 底物(20 X )，DAB 色原(20 X )。
[0007]更进一步地，作为本发明试剂盒的优化，还在试剂盒中设置用于参照的比对色卡，以方便对待测样本的染色结果进行比对，或者设置对待测样本切片中染色细胞百分数进行自动计算的计数器，以便于对样本染色结果做快速分析。
[0008]发明人通过研究发现:S100A8在结直肠癌中的表达水平明显高于正常结直肠组织，并且，S100A8蛋白的表达水平在不同分化程度结直肠癌组织中表达强度存在显著差别，高、中、低分化结直肠癌组织中，S100A8蛋白表达的强阳性率呈明显递增趋势，即分化程度越低，强阳性表达水平越高，分化程度越高，表达水平越低；同时，在转移结直肠癌组织中，S100A8蛋白阳性及强阳性表达水平明显高于非转移癌组织。因此，检测受试者结直肠组织表面S100A8的表达水平，可以作为结直肠癌的恶性程度、远处转移诊断的分子标志物。因此，发明人提供上述免疫组化试剂盒，利用该试剂盒，通过检测结直肠病理组织表面S100A8抗原的表达，能快速准确地判断结直肠癌恶性程度及转移情况，为结直肠癌的临床诊断提供帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1:分析 NCBI GEO DataSets 系列 GSE9348 中探针 202917_s_at 所对应的 S100A8在12例正常结直肠组织和70例结直肠癌组织的RNA表达结果图。
[0010]图2:免疫组化检测正常结直肠组织及高、中、低分化结直肠癌组织中S100A8蛋白的表达结果图，A-F图均为显微镜下放大200倍的组织结构图，其中:
A图:正常结直肠组织阴性对照(未加S100A8 —抗)；
B图:结直肠癌组织阴性对照(未加S100A8 —抗)；
C图:正常结直肠组织；
D图:高分化结直肠癌组织；
E图:中分化结直肠癌组织；
F图:低分化结直肠癌组织。
[0011]图3:免疫组化检测非转移癌和转移结直肠癌组织中S100A8蛋白的表达结果图，以下A、B图均为显微镜下放大200倍的组织结构图，其中:
A图:非转移结直肠癌组织；
B图:转移结直肠癌组织。
[0012]图4:S100A8蛋白在正常结直肠组织及癌组织中表达的IHC结果比较。
[0013]图5:S100A8蛋白在不同分化程度的结直肠癌组织中表达的IHC结果比较。
[0014]图6:S100A8蛋白在结直肠非转移癌和转移癌中表达的IHC结果比较。
【具体实施方式】
[0015]实施例1结直肠癌恶性程度及转移免疫组化诊断试剂盒的制备
发明人利用NCBI高通量基因表达数据库GEO DataSets (gene expression omnibus),对系列GSE9348中70例结直肠癌组织和12例正常结直肠组织进行S100A8 RNA水平芯片数据分析，结果如附图1所示。通过该研究发现:S100A8在结直肠癌中的表达水平明显高于正常结直肠组织，P〈0.05，差异具有统计学意义。发明人通过免疫组化进一步实验表明:S100A8在结直肠癌中的表达水平明显高于正常结直肠组，并且S100A8蛋白的表达水平在不同分化程度结直肠癌组织中表达强度存在显著差别，高、中、低分化结直肠癌组织中，S100A8蛋白表达的强阳性率呈明显递增趋势，即分化程度越低，强阳性表达水平越高，分化程度越高，表达水平越低；同时，在转移结直肠癌组织中，S100A8蛋白阳性及强阳性表达水平明显高于非转移癌组织。因此，检测受试者结直肠组织表面S100A8的表达水平，可以作为结直肠癌的恶性程度、远处转移诊断的分子标志物。[0016]基于上述研究结果，本发明制备出一种诊断结直肠癌恶性程度和远处转移的免疫组化检测试剂盒，该试剂盒包含:内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂。所述的一抗为人源抗S100A8单克隆抗体或鼠源S100A8单克隆抗体，所述的二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
[0017]常规各种用于免疫组化试验的内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、酶、显色剂均可用于本发明试验盒，但作为最佳选择，本实施例中内源性过氧化物酶阻断剂为3 wt%H202，所述的非特异性结合位点阻断剂为非免疫羊血清，所述酶为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，所述显色剂为DAB显色剂，包括:DAB缓冲液(20X)，DAB底物(20X)，DAB 色原(20X)。
[0018]在试剂盒中设置用于参照的比对色卡，分别为淡黄色、黄色和棕褐色。并设置一个扫描计数器，该计数器包括一个能对切片的显微图片进行扫描单元，并包含一个对所扫描到的图片进行细胞计数的分析单元。用该计数器，能对待所测样本切片中染色细胞百分数进行自动计算，以便于对样本染色结果做快速分析。
[0019]实施例2用实施例1制备的试剂盒检测结直肠癌组织样本
(1)烤片脱蜡:取结直肠癌患者组织，将待染色的组织切片放入60°c烤箱内烘烤60-90分钟(视切片质量而定)后迅速放入二甲苯(1、II)中浸泡10分钟X2次进行脱蜡；
(2)水化:切片按顺序置于以下梯度酒精中:100%乙醇中浸泡5分钟一90%乙醇中浸泡5分钟一75%乙醇中浸泡5分钟一50%乙醇中浸泡5分钟一蒸馏水中浸泡3分钟一PBS洗涤3分钟X3次；
(3)抗原修复:0.01M pH6.0的柠檬酸抗原修复液在微波炉中煮沸，切片放入其中，乳胶手套封住容器口，继续在沸水中加热15-20分钟，使温度保持在100°C，完毕容器自然冷却至室温，不要将切片从修复液中取出，后再用I X PBS缓冲液摇床上漂洗3分钟X 3次；` (4)阻断内源性过氧化物酶:将切片置于孵育盒中，用蜡笔将组织圈起来，以免滴加后的试剂扩散，吸水纸将切片上的水稍吸去，不要碰到组织，用3 wt%H202溶液100 μ I覆盖组织后室温孵育30分钟，以清除内源性过氧化物酶，然后用IXPBS缓冲液摇床上漂洗3分钟Χ3次；
(5)非特异性结合位点血清封闭:吸水纸将切片上的水稍吸去，滴加非免疫羊血清，100 μ 1，封闭30分钟，轻轻甩去上清，不漂洗；
(6)—抗孵育:在孵育盒中，滴加IXPBS稀释后的鼠源抗S100A8单克隆抗体溶液(购自ABNOVA公司)；1:200稀释，每张切片约100 μ 1，37°C孵育1_2小时，或4°C过夜，然后IXPBS缓冲液摇床上3分钟X 3次漂洗。阴性对照采用PBS代替一抗。；
(7)二抗孵育:吸水纸将切片上的水稍吸去，生物素标记的羊抗鼠IgGlOO μ I (购自福州迈新)，室温15分钟，IXPBS缓冲液摇床上3分钟X 3次进行漂洗；
(8)吸水纸将切片上的水稍吸去，每张切片滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶100 μ 1，室温孵育15分钟，再用I XPBS缓冲液摇床上3分钟X 3次进行漂洗；
(9)显色及终止:吸水纸将切片上的水稍吸去，勿干片，滴加DAB显色液DAB缓冲液(20X)、DAB底物(20X )、DAB色原(20父)各5(^1滴加至850 μ I双蒸水中配制成ImL新鲜显示液，有效使用时间为30分钟进行显色，显微镜下控制显色时间为60秒，染至棕黄色或黄褐色，完毕自来水中终止反应；(10)复染:吸水纸将切片上的水稍吸去，滴加苏木素复染15秒，迅速用自来水冲洗终止反应，自来水返蓝5-10分钟；
(11)脱水透明:晾干后依次入50wt%乙醇、75 wt%乙醇、90 wt%乙醇、100 wt%乙醇各2分钟快速脱水。再入二甲苯中2分钟进行透明；
(12)封片:待切片自然晾干后,滴加中性树胶及盖玻片封片。
[0020]实施例3用本发明试剂盒检测结直肠癌组织样本进行临床验证
用上述实施例1的试剂盒，依据实施例2的方法和步骤，检测了 54例正常和104例结直肠癌大体标本中S100A8蛋白的表达。所有组织标本在手术后经中南大学湘雅二医院病理科进行病理证实；104例结直肠肿瘤标本中58例为非转移癌，46例为远处转移癌；其中96例可用于恶性程度分析:14例高分化癌，48例中分化癌，34例低分化癌。
[0021]依据蛋白在细胞内的定位，分别以蛋白表达阳性信号强度和阳性表达细胞数两种标准进行综合评分。判断阳性表达结果标准:(1)根据阳性染色强度判断:细胞无染色记O分；细胞染成淡黄色，记I分；黄色，记2分；棕褐色，记3分。(2)根据阳性细胞表达数记分:阳性细胞数< 5%，记O分;5%~25%，记I分；26%~50%，记2分;51%~75%，记3分，>75%,记4分。最终计分结果为上述两种判断标准得分相加。结果评估:0分为阴性表达(_);1、2分为弱阳性表达(+ );3飞分为中等阳性(+ );6、7分为强阳性表达(+ )。分析组织中S100A8免疫组化的结果表明，S100A8蛋白在97.12% (101/104)的结直肠癌和37.93% (22/58)的正常结直肠组织中表达阳性，见图4和图2，即在结直肠癌组织中S100A8蛋白表达水平明显高于正常结直肠组织O^= 68.15，p=0.00)。Kruskal-Wallis H检验统计分析发现，S100A8蛋白的表达水平在不同分化 程度结直肠癌组织中表达强度有差别，I 2=?.73，P=0.021，差异有统计学意义。高、中、低分化癌强阳性率分别为14.28%,43.75%和61.76%，呈明显递增趋势，即分化程度越低，强阳性表达水平越高，见图5和图2 ;而在转移癌组织中，S100A8蛋白阳性及强阳性表达水平明显高于非转移癌组织CT "=4.21, P=0.04)，见图6和图3，差异具有统计学意义。
[0022]进一步的临床应用表明，本发明的试剂盒能用于通过检测结直肠癌组织中S100A8蛋白表达水平从而准确判断结直肠癌的组织分化程度以及转移情况，有助于快速便捷地诊断结直肠癌。
[0023]应理解，在阅读了本发明的上述公开内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请的权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.结直肠癌恶性程度及其转移的免疫组化诊断试剂盒，该试剂盒包含:内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂，其特征在于所述的一抗为人源抗S100A8单克隆抗体或鼠源抗S100A8单克隆抗体，所述的二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的内源性过氧化物酶阻断剂为3wt%H202，所述非特异性结合位点阻断剂为非免疫动物血清，所述酶为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，所述显色剂为DAB显色剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述非特异性结合位点阻断剂为非免疫羊血清。
4.根据权利要求1-3所述之一的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中设置用于染色参照的比对色卡，所述比对色卡有三张，分别为淡黄色、黄色和棕褐色。
5.根据权利要求1-3所述之一的试剂盒，其特征在于:试剂盒中设置对待测样本切片中染色细胞百分数进行自动计算的计数器。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:试剂盒中设置对待测样本切片中染色细胞百分数进行自动计算的计数器。
【文档编号】G01N33/574GK103487583SQ201310478851
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】沈守荣, 马健, 张学梅, 李夏雨, 李楠, 唐岸柳 申请人:中南大学