一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测技术。其原理是在体外通过抗原抗体反应，进行特异性检测，检测奶牛血液样品中的抗苗勒管激素水平。本发明采用定量夹心酶联免疫技术。抗体具体为AMH已经被预先涂到微孔板。标准和样品吸入井，和AMH目前任何被绑定的固定抗体。生物素共轭的抗体特异性AMH除去任何未结合的物质后，加入到孔中。抗生物素蛋白共轭的辣根过氧化物酶(HRP)的洗涤后，加入到孔中。经过洗涤，以除去任何未结合的抗生物素蛋白的酶试剂，底物溶液加入到孔中，并显色的比例AMH量的初始步骤中的约束。彩色显影被停止并测量的颜色的强度。本发明特征在于实现中国荷斯坦奶牛AMH水平的检测，作为中国荷斯坦奶牛人工授精和胚胎移植受体繁殖能力的辅助判断工具，着重提高中国荷斯坦奶牛奶牛养殖企业的繁殖效率，同时可提高中国荷斯坦奶牛卵巢储备功能、奶牛人工授精与配牛和胚胎移植受体牛的评估工作。
【专利说明】一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测方法及应用，属于生物与新医药领域，具体方向是现代农业技术。
【背景技术】
[0002]抗苗勒管激素(anti Mullerian hormone, AMH)是一种只在性腺表达的水溶性糖蛋白，参与了苗勒管萎缩、睾丸沉降、颗粒细胞分化及卵泡募集调控过程，是控制卵泡数量和性别分化的关键因子之一。它由性成熟前睾丸足细胞和性成熟后卵巢颗粒细胞分泌。牛抗苗勒管激素是高度保守的蛋白质，前体由575个氨基酸组成，前导序列包含24-25个氨基酸，其中信号肽长度大约在16-18个氨基酸左右。碳端序列基本与其他转化生长因子B家族成员相同。转化生长因子B超家族蛋白质在距离碳端110个氨基酸左右具有一个特异性裂解位点，与转化生长因子活性有关。牛抗苗勒管激素前体在距碳端109个氨基酸处被裂解后形成一个IlOku氮端同源二聚体和一个57ku碳端同源二聚体，前者可以增强后者的活性。
[0003]抗苗勒管激素在卵巢颗粒细胞中表达。雌性动物出生至青春期之前不表达抗苗勒管激素，性成熟后的雌性动物随着年龄增长，卵巢功能和AMH表达水平逐年退化。初级卵泡和小黄卵泡同质表达抗苗勒管激素，大卵泡只是在卵细胞以及窦泡周围的颗粒细胞表达抗苗勒管激素，闭锁卵泡以及膜细胞不表达抗苗勒管激素。动物在青春期之前性腺分泌抗苗勒管激素的模式存在明显的性别差异，血液中抗苗勒管激素浓度雄性的明显高于雌性的，青春期之后血液抗苗勒管激素浓度都降低，两性之间差别不明显。
[0004]抗苗勒管激素通过一种II型丝氨酸-苏氨酸激酶膜蛋白发挥其生物学效应，该蛋白被称作抗苗勒管激素II型受体(AMHR II)。AMHR II只在性腺表达，表明抗苗勒管激素只能以自分泌或旁分泌的形式发挥生理功能。像其它TGFB超家族成员一样，抗苗勒管激素通过两种受体、两个效应分子激活Smad信号通路。抗苗勒管激素首先与II型受体结合，有结构酶活性的II型受体使I型受体磷酸化并激活，I型受体再激活R-Smad，后者结合Smad4形成复合物并转运到细胞核，在细胞核复合物与靶基因(或报告基因)启动子Smad结合元件结合。利用Cre / 1xP系统组织特异性灭活目标基因，证实2种I型TGFB受体，也就是Acvrl和Bmprla,以及3种Smad蛋白介导了抗苗勒管激素信号转导。
[0005]卵泡刺激素可以促进抗苗勒管激素表达。研究表明卵泡刺激素B亚基基因缺陷型小鼠青春期前血液中抗苗勒管激素水平较低，而当注射外源FSH之后，抗苗勒管激素水平恢复正常，提示FSH可能参与了 AMH基因表达调控过程。GnRH颉颃剂可以降低窦前卵泡抗苗勒管激素表达水平；在排除内源GnRH和睾酮干扰的情况下，外源FSH可以提高血液中抗苗勒管激素浓度；低促性腺素性功能减退症患者在注射重组FSH后，精浆抗苗勒管激素表达水平升高。FSH通过PKA提高AMH基因表达水平，在huAMH基因转录起始位点上游存在NF- K B和A P2结合位点。将NF- K B或AP2位点诱发突变可以降低转录水平，并且敲除NF- K B位点也可以降低抗苗勒管激素表达水平。[0006]抗苗勒管激素在卵泡发育过程中有着重要作用。卵泡发育主要由卵泡初始募集以及循环募集组成。在胚胎期初级卵泡的柱状颗粒细胞最先检测到抗苗勒管激素，之后卵泡持续表达抗苗勒管激素，高峰期出现在窦前卵泡以及窦腔小卵泡，大卵泡分泌量减少，闭锁卵泡检测不到抗苗勒管激素。抗苗勒管激素表达模式表明其在调节卵泡数量以及优势卵泡的选择方面有着重要作用。敲除AMH基因的表现为初级卵泡进入成长卵泡的速率增强，因而初级卵泡库过早的消耗殆尽。体外细胞培养试验证实抗苗勒管激素可以抑制初始卵泡的募集。抗苗勒管激素通过调节卵泡对FSH的敏感程度精细选择进入优势卵泡的次序。小鼠试验表明，缺少抗苗勒管激素时窦状大卵泡对FSH更加敏感。体外细胞培养试验证明抗苗勒管激素可以抑制FSH依赖的卵泡成长过程，颗粒细胞培养试验也表明抗苗勒管激素可以减弱FSH依赖的芳香化酶活性。在窦腔小卵泡，抗苗勒管激素浓度与雌激素浓度呈负相关，表明抗苗勒管激素生成与FSH活性密切相关。近来发现，AMH及AMHRII碱基变异可以改变窦腔卵泡雌激素产生过程并加速卵泡成长，表明抗苗勒管激素信号转弱可以增强依赖FSH的卵泡生长和激素合成过程。
[0007]抗苗勒管激素及其受体是影响家养动物繁殖性能的重要因素，群体内个体间抗苗勒管激素基因及其受体基因可能存在差异，这也是人工选择可以利用的地方。在培育高繁殖力高产品种及胚胎移植时，血液抗苗勒管素浓度可能成为有用的选择指标。
[0008]本发明提供一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测技术，从而实现对实现中国荷斯坦奶牛AMH水平的检测，提高中国荷斯坦奶牛卵巢储备功能、奶牛人工授精与配牛和胚胎移植受体牛的评估工作，还可以作为中国荷斯坦奶牛人工授精和胚胎移植受体繁殖能力的辅助判断工具，着重提高中国荷斯坦奶牛奶牛养殖企业的繁殖效率
【发明内容】
[0009]本发明是一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测技术。
[0010]该发明提供的方法是通过是在体外通过抗原抗体反应，进行特异性检测，检测奶牛血液样品中的抗苗勒管激素水平。本发明采用定量夹心酶联免疫技术。抗体具体为AMH已经被预先涂到微孔板。标准和样品吸入井，和AMH目前任何被绑定的固定抗体。生物素共轭的抗体特异性AMH除去任何未结合的物质后，加入到孔中。抗生物素蛋白共轭的辣根过氧化物酶(HRP)的洗涤后，加入到孔中。经过洗涤，以除去任何未结合的抗生物素蛋白的酶试剂，底物溶液加入到孔中，并显色的比例AMH量的初始步骤中的约束。彩色显影被停止并测量的颜色的强度。
[0011]其中，所述哺乳动物为奶牛。
[0012]本发明的方法能作为中国荷斯坦奶牛人工授精和胚胎移植受体繁殖能力的辅助判断工具，还可以用于中国荷斯坦奶牛卵巢储备功能、奶牛人工授精与配牛和胚胎移植受体牛的评估工作率。
【具体实施方式】
[0013]下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。
[0014]AMH抗体和反应试剂购于sigma公司。[0015]PG购于上海计划生育研究所。
[0016]FSH购于中国科学院动物研究所。
[0017]实施例1，样品采集和存储
[0018]血清:使用血清分离管(SST)和全血标本在室温下两小时或4°C过夜。C，然后离心15分钟，在1000Xg下。删除上清即可检测，或分装和店内样品在_20°C或-80°C。但应避免反复冻融循环。
等离子:采集血浆中EDTA或肝素作为抗凝血剂。在2-8°C在30分钟内收集离心15分钟，1000XG。即可检测，或分装保存样本在-20°C或-80°C。但应避免反复冻融循环。
[0019]实施例2，检测流程
[0020]①准备好所有试剂，工作标准和样品在前面的章节中。
[0021]②请确定井数的使用，并把任何剩余的井和入袋干燥剂，密封保鲜袋，将未使用的井在4°C的含量布局表。
[0022]③每孔加入100 μ I的标准和样品。封面用胶粘带提供。孵育2小时，在37°C下一盘布局记录标准和样品检测。
[0023]④每孔中取出的液体，不洗。
[0024]⑤向每孔中加入100 μ I生物素抗体(I倍)。盖上一个新的胶粘带。孵育I小时，在37°C下(生物素抗体(IX)可能会出现混浊。预热至室温，轻轻混匀，直到出现均匀解决方案。)`
[0025]⑥吸液的各孔和洗涤，共洗涤三次重复该过程两次。洗净，每孔填充洗涤缓冲液(200 μ L)使用喷瓶，多道移液器，歧管器，或autowasher，和，静置2分钟，彻底清除液体的每一步是必不可少的良好的性能。最后一次洗涤后，清除任何剩余洗涤缓冲液的吸ordecanting。倒置板和涂抹对干净的纸巾。
[0026]⑦向每孔中加入100μ I的HRP-抗生物素蛋白(IX)。量的微量滴定板，用一个新的粘接剂条。温育I小时，在37°C下
[0027]⑧重复的愿望/洗涤过程中，在步骤6的5倍。
[0028]⑨将90 μ ITMB底物添加到每个孔中。孵育15-30分钟，在37。°〇下避光。
[0029]⑩一站式解决方案，每孔加入底物，轻轻晃动酶标板，以确保充分混合。在5分钟内，设置至450nm，使用酶标仪测定各孔的光密度。如果波长校正，设置为540nm或570nm处。在540nm或570nm波长在450nm处的读数减去读数。该减法校正板的光学缺陷。
[0030]实施例3，结果计算
[0031]使用专业的软业的“曲线专家1.3”软件绘制标准曲线。
[0032]平均每个标准和样品的重复读数和平均减去零标准的光学密度。
[0033]标准曲线，通过减少使用能产生四参数逻辑(4-PL)的曲线拟合的计算机软件的数据。作为一种替代方法，建立标准曲线，对在1-轴的浓度通过绘制在X-轴为每个标准的平均吸光度，并绘制一个通过在曲线图上的点的最佳拟合曲线。该数据可以通过绘制日志的AMH浓度与日志的OD和可以通过回归分析确定的最佳拟合线线性化。
[0034]实施例4，AMH检测应用于奶牛人工授精
[0035](I)通过例3计算结果，对AMH浓度合适的奶牛进行选配计划。
[0036](2)精液解冻:用长柄镊子从贮藏罐中取出细管后，直接放入38°C _40°C温水中解冻，全部融化后取出，擦干水，用专用剪刀剪开细管，套上外套管备用。
[0037](3)人工输精:采用直肠把握输精法。输精前应先将待配母牛保定于配种架中，用温肥皂水将阴门附近的粪便、污物冲洗干净，然后用温水冲洗，用卫生纸擦干。输精员将手指甲剪短磨光，手臂套上乳胶手套，涂上一层润滑剂，五指并拢成锥形，插入直肠，排出粪便。隔着直肠壁握住子宫颈管。左手臂稍微下压，使阴门开张。右手持输精枪，由阴门缓缓插入，开始先稍向上斜插，避开尿道口，然后再向下平插至子宫颈口，将输精管前端深入子宫颈口内3cm-4cm(约2_3个皱壁)，将输精枪稍微后拉即可输精，输精后缓慢拔出输精管(枪)。
[0038]实施例5，AMH检测应用于胚胎移植
[0039](一 )受体牛处理
[0040]在AMH浓度合适的情况下，使用前列腺素(PGF2ci) —次肌注，诱导发情。给处于情期8?15d且直肠检查黄体的受体牛一次注射PGF2 α。
[0041](二)发情观察
[0042]根据母牛接受爬跨确认为发情、早、晚各观察30min发清情况。对发情牛需做直肠检查，以确认卵泡，次日上午或晚上做直肠检查确定是否排政若在发情后36h以后排卵的牛不能用作受体牛。
[0043](三)胚胎移植
[0044](I)受体牛检查:移植前直检黄体，其直径在11?15_以上，黄体的手感性好，质地软而充实。
[0045](2)受体牛的准备:将受体牛保定，清除粪便，肌注2%静松灵Iml或用2%的普鲁卡因3ml在I?2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。
[0046](3)器械准备:先将移植枪、抢头及金属保护外套消毒。
[0047](4)胚胎解冻:胚胎细管从液氮内环状保护外套内取出后，空气中停留5秒钟，放置在35-38°C温水内水浴20秒。用纸擦干细管以便于抓牢细管从而将插头从细管上拧下。保留标签用于识别胚胎信息。胚胎细管放入移植枪内，戴好外套。
[0048](5)胚胎移植术者用左手扒开外阴，右手持移植器插入阴道，然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手用力将移植枪捅破外套填片，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体例子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。
[0049](6)妊娠诊断:采用直肠检查法，在移植后2个月开始检查。
【权利要求】
1.本发明提供一种中国荷斯坦奶牛抗苗勒管激素检测技术。其原理是在体外通过抗原抗体反应，进行特异性检测，检测奶牛血液样品中的抗苗勒管激素水平。本发明采用定量夹心酶联免疫技术。抗体具体为AMH已经被预先涂到微孔板。标准和样品吸入井，和AMH目前任何被绑定的固定抗体。生物素共轭的抗体特异性AMH除去任何未结合的物质后，加入到孔中。抗生物素蛋白共轭的辣根过氧化物酶(HRP)的洗涤后，加入到孔中。经过洗涤，以除去任何未结合的抗生物素蛋白的酶试剂，底物溶液加入到孔中，并显色的比例AMH量的初始步骤中的约束。彩色显影被停止并测量的颜色的强度。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于实现中国荷斯坦奶牛AMH水平的检测。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于作为中国荷斯坦奶牛人工授精和胚胎移植受体繁殖能力的辅助判断工具，着重提高中国荷斯坦奶牛奶牛养殖企业的繁殖效率。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于提高中国荷斯坦奶牛卵巢储备功能、奶牛人工授精与配牛和胚胎移植受体牛的评估工作。
【文档编号】G01N33/74GK103499696SQ201310485055
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】马毅, 姚强, 赵庆彬 申请人:天津市奶牛发展中心