肺癌标记物分子的快速体外检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】用于检测早期肺癌的试剂盒，其特征在于，包括试剂A、B、C、D、E、F和标准液，具体试剂如下：试剂A的组成为碘化钠(NaI)和碘(I2)；试剂B的组成为氢氧化钠,试剂C为2-（N-吗啉代）乙磺酸,PH值为弱碱性,试剂D为去离子纯净水,试剂E为氯化氢,试剂F为Tris,borate,EDTA；标准液为黄蝶呤溶于2-（N-吗啉代）乙磺酸，有益效果：成本降低,灵敏度大大提升,无需昂贵仪器的支持,仪器维护费用降低,所需要的溶剂量减少,需要的样品量较小,且样品处理过程简化.整个测试时间减少。
【专利说明】肺癌标记物分子的快速体外检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一组癌症标记物分子的检测试剂盒，属于生物医药【技术领域】，尤其涉及癌症早期分子诊断。
【背景技术】
[0002]肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明:长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10?20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。
[0003]和其他许多癌症类似，肺癌的发生源于癌基因的激活，或抑癌基因的丧失活性。癌基因指的是那些使人容易得癌症的基因。通常认为原癌基因在遇到致癌物以后会变成癌基因。大鼠肉瘤蛋白(RAS)原癌基因的基因突变大约造10-30%肺腺癌。表皮生长因子受体(EGFR)控制着细胞的分裂，凋零，抑制血管生成，和肿瘤侵蚀EGFR基因突变和扩增在非小细胞肺癌中很常见，因此才有采用EGFR抑制剂的治疗基础。但Her2/neu蛋白很少受影响。染色体损伤会导致基因杂合缺失。这可造成抑癌基因丧失活性。在小细胞肺癌中，经常见到3p，5q，13q，和17p染色体损伤。60_75%的病例在17p染色体上p53抑癌基因受影响。其他经常发生突变和扩增的基因有c-MET，NKX2-1, LKBI, PIK3CA,和BRAF多种基因多态性和肺癌有关，包括白细胞介素-1，细胞色素P450,细胞凋亡的促进因子(比如caspase-8),和DNA修复分子(比如XRCC1)。有这些基因多态性的人在接触致癌物质后更容易得肺癌。
[0004]目前对肺癌的诊断主要是通过影像学的应用，例如X线检查，通过X线检查可以了解肺癌的部位和大小，可能看到由于支气管阻塞引起的局部肺气肿、肺不张或病灶邻近部位的浸润性病变或肺部炎变。支气管镜检查，通过支气管镜可直接窥察支气管内膜及管腔的病变情况。可采取肿瘤组织供病理检查，或吸取支气管分泌物作细胞学检查，以明确诊断和判定组织学类型。细胞学检查痰细胞学检查是肺癌普查和诊断的一种简便有效的方法，原发性肺癌病人多数在痰液中可找到脱落的癌细胞。中央型肺癌痰细胞学检查的阳性率可达70%?90%，周围型肺癌痰检的阳性率则仅约50%。剖胸探查术，肺部肿块经多种检查和短期诊断性治疗仍未能明确病变性质，肺癌的可能性又不能除外者，应作剖胸探查术。这样可避免延误病情致使肺癌患者失去早期治疗的机会。ECT检，ECT骨显像可以较早地发现骨转移灶。X线片与骨显像都有阳性发现，如病灶部成骨反应静止，代谢不活跃，则骨显像为阴性，X线片为阳性，二者互补，可以提高诊断率。需要注意的是ECT骨显像诊断肺癌骨转移的假阳性率可达20%?30%，因此ECT骨显像阳性者需要作阳性区域骨的MRI扫描。纵隔镜检查，纵隔镜检查主要用于伴有纵隔淋巴结转移，不适合于外科手术治疗，而其他方法又不能获得病理诊断的病人。纵隔镜检查需在全麻下进行。在胸骨上凹部做横切口，钝性分离颈前软组织到达气管前间隙，钝性游离出气管前通道，置入观察镜缓慢通过无名动脉之后方，观察气管旁、气管支气管角及隆突下等部位的肿大淋巴结，用特制活检钳解剖剥离取得淋巴结组织送病理学检查。
[0005]癌症发生时，某些生理指标以及全细胞，会在任一特定的组织或流通。检测的生物标志物，单独或作为较大的数据集或图案，可以通过各种各样的方法，包括从血液或组织样品的生化分析，生物医学成像。[0006]蝶啶癌症筛选研究在过去的二十年中成为焦点，蝶啶水平要显着升高时，细胞免疫系统被激活的某些疾病，如癌症，病毒感染，和肾脏病已报告。在肿瘤相关的疾病中不同的蝶啶衍生物可以扮演各种角色。每种类型的肿瘤很可能会导致不同模式的蝶啶浓度的变化。因为目标蝶啶水平已被证明反映不同的的癌症患者代谢产物中。本发明使用高效毛细管电泳一激光诱导荧光的检测方法，开发了一些列诊断试剂盒和配套标准试剂，来分析肺癌患者及健康人体尿样中黄蝶呤。高性能液相色谱(HPLC)的方法已被用于黄蝶呤分析。但是，它费时昂贵，并导致了不能令人满意的分离，尤其是对真实的尿液样本，从而影响检测的准确率和灵敏度。另一方面，高效毛细管电泳法(HPCE)是快速而有效的，只需要一个小的样本大小。此专利开发并优化了高效毛细管电泳-激光诱导荧光的检测方法来定量分析尿样中的黄蝶呤。
[0007]目前针对蝶呤类分子检测的手段多使用高性能液相色谱(HPLC)和高性能液相色谱连用质谱(LC-MS).无论是HPLC或者LC-MS，有以下缺点:
[0008]I)昂贵的仪器作为支持，平均HPLC体系需要20万人民币，LC-MS闻达百万人民币；
[0009]2)仪器维护费用高，每年仪器维护费用高到仪器价格的10-15% ；
[0010]3)所需要的溶剂量巨大，给环境带来很大污染.分析同样一个样品，本发明需要的溶剂量是HPLC LC-MS的1/4 ；
[0011]4)需要的样品量较大；
[0012]5)因为需要液相色谱的分离，所以要求相对简单的样品，也就是说需要预处理样品，把样品中的其他杂质在分析前除去，这就加大了样品准备的难度，增加了分析时间和成本，因为需要额外的工具和耗材来处理样品；
[0013]6)灵敏度偏低；
[0014]7)每个样品的分析时间偏长。
【发明内容】
[0015]发明目的:解决早期肺癌检测费用过高，灵敏度低问题。
[0016]技术方案:收集到的尿样将会用此试剂盒来处理，生成的混合液将是最终在仪器上分析的最终样品.[0017]肺癌标记物分子的快速体外检测试剂盒，其特征在于，包括试剂A、B、C、D、E、F和标准液，具体试剂如下:
[0018]试剂A的组成为4%碘化钾(NaI)和2%的碘(12)两处百分比均为质量/体积.[0019]试剂B的组成为2摩尔每升的氢氧化钾，
[0020]试剂C为50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸，PH值为7.7，[0021]试剂D为500微升去离子纯净水，
[0022]试剂E为500微升2摩尔每升的氯化氢，
[0023]试剂F为500微升0.1摩尔每升Tris, 0.1摩尔每升borate, 2摩尔每升EDTA ；
[0024]标准液如下:
[0025]标准溶液I为0.01克每升的黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸；
[0026]标准溶液2为1x10-3克每升异黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0027]标准溶液3为1x10-4克每升异黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0028]标准溶液4为1x10-5克每升异黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0029]标准溶液5为1x10-6克每升异黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸。
[0030]有益效果:成本降低，灵敏度大大提升，无需昂贵仪器的支持，仪器维护费用降低，所需要的溶剂量减少，需要的样品量较小，且样品处理过程简化.整个测试时间减少。
[0031]制备方法如下试剂A:首先溶解碘化钾在I升电离水`，充分交办至全部溶解，再将碘加入到溶液，在37摄氏度下中速搅拌45分钟.最终溶液需分装在放铝箔纸包裹的2毫升样品罐中，每个2毫升样品罐中存有500微升处理试剂.试剂需放置在4摄氏度冰箱中.[0032]试剂B:2摩尔每升的氢氧化钾，储存形式为200微升每2毫升样品罐中.[0033]试剂C: 50微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值为7.5，300微升每2毫升样品罐中存放.[0034]试剂D:500微升去离子纯净水，同样存于2毫升样品罐中.[0035]试剂E:500微升2摩尔每升的氯化氢，同样存于2毫升样品罐中.[0036]试剂F:500微升0.1摩尔每升Tris, 0.1摩尔每升borate, 2摩尔每升EDTA同样存于2毫升样品--中.[0037]标准溶液I为0.01克每升的黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸；
[0038]标准溶液2为1x10-3克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0039]标准溶液3为1x10-4克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0040]标准溶液4为1x10-5克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0041]标准溶液5为1x10-6克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸。
【专利附图】
【附图说明】[0042]图1黄蝶呤标准样品的电泳图；
[0043]图2患者与健康人尿样中黄蝶呤含量图。
【具体实施方式】
[0044]肺癌标记物分子的快速体外检测试剂盒，其特征在于，包括试剂A、B、C、D、E、F和标准液，具体试剂如下:
[0045]试剂A的组成为4%碘化钾(NaI)和2%的碘(12)两处百分比均为质量/体积.[0046]试剂B的组成为2摩尔每升的氢氧化钾，
[0047]试剂C为50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸，PH值为7.7，
[0048]试剂D为500微升去离子纯净水，
[0049]试剂E为500微升2摩尔每升的氯化氢，
[0050]试剂F为500微升0.1摩尔每升Tris, 0.1摩尔每升borate, 2摩尔每升EDTA ；
[0051]标准液如下:
[0052]标准溶液I为0.01克每升的黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸；
[0053]标准溶液2为1x10-3克每升异黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0054]标准溶液3为1x10-4克每升异黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0055]标准溶液4为1x10-5克每升异黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸；
[0056]标准溶液5为1x10-6克每升异黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2_ (N-吗啉代)乙磺酸。
[0057]本专利不涉及人体尿样中肌酐的测定，该数据通过本实验室其他方法得到.[0058]乳腺癌患者的9个人体尿样来自于Ellis Fischel Cancer Center, Columbia MOUSA,患者均未接受过化学或者放射治疗的，患者的地域分布为美国密苏里州，年龄在26-70岁之间，期间没有对患者的饮食和运动有任何限制.10个健康人体的尿液样本来自于美国密苏里大学的在校学生志愿者，没有采取任何药物包括维生素补充剂，年龄范围在22-45岁.如图2所示。其标准曲线如图1所示。
【权利要求】
1.一种肺癌标记物分子的快速体外检测试剂盒，其特征在于，包括试剂A、B、C、D、E、F和标准液，具体试剂如下: 试剂A的组成为4%碘化钾(NaI)和2%的碘(12)两处百分比均为质量/体积.试剂B的组成为2摩尔每升的氢氧化钾， 试剂C为50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸，PH值为7.7， 试剂D为500微升去离子纯净水， 试剂E为500微升2摩尔每升的氯化氢， 试剂F为500微升0.1摩尔每升Tris, 0.1摩尔每升borate, 2摩尔每升EDTA ； 标准液为黄蝶呤溶于2- (N-吗啉代)乙磺酸。
2.根据权利要求1所述的用于检测早期乳腺癌的试剂盒，其特征在于，标准液配方如下: 标准溶液I为0.01克每升的黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸； 标准溶液2为1x10-3克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸； 标准溶液3为1x10-4克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸； 标准溶液4为1x10-5克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸； 标准溶液5为1x10-6克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸。
3.权利要求1或2试剂盒的制备方法，其特征在于， 试剂A:首先溶解碘化钾在I升电离水中，充分交办至全部溶解，再将碘加入到溶液，在37摄氏度下中速搅拌45分钟.最终溶液需分装在放铝箔纸包裹的2毫升样品罐中，每个2毫升样品罐中存有500微升处理试剂.试剂需放置在4摄氏度冰箱中.试剂B:2摩尔每升的氢氧化钾，储存形式为200微升每2毫升样品罐中.试剂C:50微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值为7.5，300微升每2毫升样品罐中存放.试剂D:500微升去离子纯净水，同样存于2毫升样品罐中.试剂E:500微升2摩尔每升的氯化氢，同样存于2毫升样品罐中.试剂F: 500微升0.1摩尔每升Tris, 0.1摩尔每升borate, 2摩尔每升EDTA同样存于2晕升样品iiS中.标准溶液I为0.01克每升的黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸； 标准溶液2为1x10-3克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸； 标准溶液3为1x10-4克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸； 标准溶液4为1x10-5克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸； 标准溶液5为1x10-6克每升黄蝶呤溶于50微摩尔每升的2- (N-吗啉代)乙磺酸。
【文档编号】G01N33/574GK103513034SQ201310486121
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】成晓亮, 季军, 马银法 申请人:江苏禾尔思生物科技有限公司