血清或血浆样品稀释液及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种血清或血浆样品稀释液及其用途，具体地，所述血清或血浆样品稀释液包括：(a)缓冲溶液；(b)白蛋白，所述白蛋白的含量为10～100g/L；(c)碱金属氯化物；以及(d)任选的乳化剂，并且所述稀释液pH值为6.0～8.0。本发明的稀释液与现有人阴性混合血清或血浆以及小牛血清类稀释液相比，具有检测结果精密准确、可长期稳定保存的特点。本发明还公开了一种含有本发明稀释液的检测试剂盒以及本发明稀释液在免疫分析法中的用途。
【专利说明】血清或血浆样品稀释液及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物样品检测【技术领域】，具体涉及一种血清或血浆样品稀释液及其用途。
【背景技术】
[0002]目前新型的全自动免疫分析仪因其操作简单，自动化程度高，检测速度快，重复性好，精密度高，可以在不需要分离的条件下，可以分别单独定量测定存在于血清或血浆样本中数十种具有临床意义的微量蛋白质。但是，临床检验中许多免疫学指标由于方法学的局限性(例如全自动免疫分析仪的检测线性范围较窄)和生物学差异性(检测样本中特种蛋白的浓度较高)，使得检测结果往往超出线性范围上限，需要进行一定比例稀释才能得到精确的检测结果。自动免疫分析仪检测样本量多，使用的试剂耗量大，因此样本稀释液成为临床医学诊断中最常用的的试剂之一。稀释液的选用是否合适会直接影响结果的准确性和可靠性。
[0003]目前，国内大型医疗单位和医学科研院所使用的进口自动免疫分析仪主要有进口免疫分析仪，其都有配套专用的稀释液。由于这些试剂进口依赖性高，成本昂贵，增加了患者医疗费用，而血液或血浆样本免疫分析又是许多疾病临床诊断的主要依据之一，因此，迫切需要推动进口试剂国产化，节省疾病诊断成本，减轻患者负担。因此研究一种既经济又可靠的国产化自动免疫分析仪配套使用的稀释液意义重大。
[0004]影响全自动免疫分析仪检测血清或血浆样本中特种蛋白结果的准确度，精密度等的主要因素有:1)抗原抗体反应体系的最适宜PH值；2)提供抗原抗体反应的合适的胶体渗透压(即蛋白浓度)；3)抗原抗体保持空间结构最佳状态所需的等渗反应环境；4)抗原抗体反应体系中最佳的离子强度等。稀释液对样本进行稀释，势必会改变血清或血浆中原有的体系环境，因此就需要稀释液能维持抗原抗体所需的最佳反应条件。
[0005]早年有报道，在临床检验中，当进口原装稀释液不足的情况下，有使用蒸馏水或者生理盐水对血清或血浆样本进行稀释后在行检测，但是单纯的蒸馏水或者生理盐水不能提供抗原抗体所需的最佳反应条件，使检测结果偏差较大，往往影响临床疾病诊断。
[0006]2009年，刘成忠等报道，采用灭活血清或已知肌酸激酶(CK)浓度值的正常血清进行稀释检测血清中肌酸激酶的浓度，其检测结果较原值无显著性差异，但是在日常工作中用灭火血清对高值血清进行稀释测定易受到要事先准备灭活血清的限制；而用已知CK值的正常血清作为稀释液对高值血清CK值测定中，检测结果需要把带入的CK值扣除掉，因此，操作结果繁琐，在临床检测诊断中有诸多不便。
[0007]2011年，余文辉等报道，利用人血浆(HBsAg、HBV-DNA和抗HIV-l/HIV-2呈阴性)自制成80%血浆稀释液替代原装进口稀释液进行稀释检测，检测结果与原值无显著性差异，在临床检测中可用。同年戴玉柱等采用混合人阴性血清或等渗的小牛血清作为替代稀释液；2012年曾庆洋采用男性健康阴性血清替代原装进口稀释液，稀释血清样本后对HCG浓度进行检测，都获得良好的检测结果。然而由于人阴性血浆或者血清，来源不稳定，不利于医疗机构大量检测中随用随取；且不同的检测项目中，人阴性血清的要求标准并非一致，不便于作为通用稀释液。此外，无论是人血清或血浆，还是一定浓度的小牛血清，含有高蛋白，容易滋生细菌，稳定性欠佳，都不利于长期保存；血清或血浆样本粘稠度都较高，采用单纯采用人阴性血清或血浆、小牛血清进行稀释，受检测时间限制，往往难以稀释混合均匀，导致检测结果容易存在一定的偏差。
[0008]因此提供一种原材料试剂易得且价廉，同时检测结果精确可靠，分散效果良好，可长期稳定保存，并且可通用于不同的临床免疫诊断项目的血清或血浆样本稀释液，对于临床医学诊断具有重要意义。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种血清或血浆样品稀释液及其在临床医学诊断中用途。
[0010]本发明第一方面提供了一种血清或血浆样品稀释液，所述稀释液包括:
[0011](a)缓冲溶液；
[0012](b)白蛋白，所述白蛋白的含量为10?100g/L ；
[0013](c)碱金属氯化物；以及
[0014](d)任选的乳化剂；
[0015]并且所述稀释液的pH值为6.0?8.0。
[0016]在另一优选例中,所述白蛋白选自:血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白。
[0017]在另一优选例中，所述血清蛋白选自:人血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白或其组合。
[0018]在另一优选例中，所述白蛋白为冻干粉末状。
[0019]在另一优选例中，所述白蛋白的含量为30?90g/L。
[0020]在另一优选例中，所述白蛋白含量优选为为45?75g/L。
[0021]在另一优选例中，所述缓冲溶液选自:磷酸缓冲溶液(PB)、磷酸盐缓冲溶液(PBS )、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(Tr i s-HCl)或其组合。
[0022]在另一优选例中，所述缓冲溶液的含量为0.01?0.2mol/L，优选为0.01?0.05mol/L。
[0023]在另一优选例中，所述碱金属氯化物的含量为2?5g/L，优选为3?4g/L。
[0024]在另一优选例中，所述碱金属氯化物选自:NaCl、KCl或其组合。
[0025]在另一优选例中，所述乳化剂含量为0.08?0.10wt%,按稀释液的总重量计。较佳地，乳化剂含量为0.09wt%。
[0026]在另一优选例中，所述乳化剂选自:脂肪醇聚氧乙烯醚。
[0027]在另一优选例中，所述乳化剂选自:E1005、E1304或其组合。
[0028]在另一优选例中，所述稀释液还包括选自下组的一种或多种组分:
[0029](a)金属离子螯合物；
[0030](b)碱金属硫酸盐；
[0031](c)防腐剂。
[0032]在另一优选例中，所述金属离子螯合物的含量为0.05?0.08wt%，按稀释液总重量计，优选为0.06?0.07wt%o[0033]在另一优选例中，所述金属离子螯合物选自:EDTA、EDTA衍生物或其组合。
[0034]在另一优选例中，所述EDTA衍生物包括:EDTA碱金属盐、乙二醇-双-(3_氨基-乙醚)N-N，-四乙酸(EGTA)。
[0035]在另一优选例中，所述碱金属硫酸盐的含量为0.2?0.6g/L，优选为0.3?0.4g/L。
[0036]在另一优选例中,所述碱金属硫酸盐选自:Na2S04、K2SO4或其组合。
[0037]在另一优选例中，所述防腐剂的含量为0.03?0.08wt%,按稀释液总重量计。优选为 0.03 ?0.05wt%,更优选为 0.04wt%o
[0038]在另一优选例中，所述防腐剂选自:叠氮钠、Proclin300、双咪唑烷基脲、异噻唑啉酮、1-羟基吡啶-2-硫酮、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯基酸乙酯、广谱杀菌剂或其组合。
[0039]在另一优选例中，所述稀释液由以下组分组成:
[0040](a) 0.01 ?0.2mol/L 缓冲溶液；
[0041](b) 10 ?100g/L 白蛋白；
[0042](c) 2?5g/L碱金属氯化物；
[0043](d) 0.08 ?0.10wt% 乳化剂；
[0044](e) 0.05?0.08wt%金属离子螯合物；
[0045](f) 0.2?0.6g/L碱金属硫酸盐；和
[0046](g) 0.03 ?0.05wt% 防腐剂；
[0047]其中，质量百分数按稀释液总重量计。
[0048]在另一优选例中，所述稀释液具有以下的一种或多种特性:
[0049](a)所述稀释液在室温下的电导率P为0.55 X IO4?0.75 X IO4 μ S/cm ；
[0050](b)所述稀释液为待测样本提供的渗透压为250?380m0sm/Kg ；
[0051](c)所述稀释液的pH为7.2?7.8。
[0052]在另一优选例中，所述待测样本为人血清或血浆样品。
[0053]本发明第二方面提供了一种免疫分析方法，所述方法包括使用第一方面所述的稀释液进行血清或血浆样品检测的步骤。
[0054]在另一优选例中，所述稀释液用于测定血清或血浆样品中的特定蛋白含量，所述特定蛋白为能与抗体发生特异性结合的蛋白。
[0055]在另一优选例中，所述特定蛋白包括:血清或血浆中的肿瘤标志物、激素和感染性疾病类的免疫学指标。
[0056]本发明第三方面提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的稀释液。
[0057]在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书和用于盛装所述稀释液的容器。
[0058]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【具体实施方式】
[0059]发明人经过广泛深入的研究，意外发现包含特定浓度的白蛋白、缓冲溶液、碱金属氯化物和乳化剂的血清或血浆样品稀释液与现有的人阴性混合血清或血浆以及小牛血清类稀释液相比，具有检测结果精密准确、可长期稳定保存的特点。在此基础上完成了本发明。
[0060]本发明中的缓冲溶液、白蛋白、碱金属氯化物和碱金属硫酸盐的含量均按稀释液总体积计。
[0061]本发明所述“任选的”是指稀释液可以包括该组分也可以不包括该组分。
[0062]血清或血浆样品稀释液
[0063]本发明的稀释液的成分主要包括:白蛋白、缓冲溶液和碱金属氯化物，其中，白蛋白可选自包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白等在内的血清蛋白，较佳地选自:人血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白或其组合，更佳地为牛血清白蛋白。
[0064]稀释液中白蛋白的含量应与待测血清或血浆样品中的蛋白浓度相匹配，白蛋白含量的过低或过高，容易对稀释液的稀释效果产生不利影响。
[0065]此外，合适的胶体渗透压(即蛋白浓度)是影响血清或血浆样本中特种蛋白检测结果准确度和精密度的主要因素之一，本发明中，白蛋白的含量优选为10?100g/L，更优选为30?90g/L，最优选为45?75g/L。从而使稀释液为待检样本提供了较佳的抗原抗体反应所需胶体渗透压环境(250?380m0sm/Kg)，从而更好地提高了稀释后样本检测准确度和精密度。白蛋白含量过低，稀释液将不能提供血清样本中原有的胶体渗透压环境，从而导致稀释后样本中的特定蛋白的测定不准确。白蛋白含量过高将提高稀释液的生产成本。
[0066]本发明的稀释液是采用常规原料进行特定组合而形成的，不同于目前已知的人阴性血浆或者血清，其来源不稳定，不利于医疗机构大量检测中随用随取；且不同的检测项目中，人阴性血清的要求标准并非一致，不便于作为通用稀释液。而本发明的稀释液可通用于不同的临床免疫诊断项目中，可针对不同的人血清样本提供稳定适宜的渗透压，且不会对不同的检测项目(即不同的血清样本)造成干扰，因此具有很高的通用性。
[0067]本发明中的白蛋白优选以冻干粉的形式加入上述稀释液中，以提高稀释后检测样本的准确度和精密度。
[0068]缓冲溶液优选为不含钙离子和镁离子的缓冲溶液，一类优选的例子包括:磷酸缓冲溶液(PB)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)和三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl)，由于缓冲溶液的过酸或过碱以及浓度大小都会对反应体系中的荧光产生不利影响，导致检测结果不准确。因此本发明缓冲溶液的含量优选为0.01?0.2mol/L,更优选为0.01?0.05mol/L。并且通过缓冲溶液pH值的调节使得稀释液的pH值维持在6.0?8.0 (更佳地在7.2?7.8)，从而为抗原抗体反应体系提供了最适宜pH值。
[0069]在本发明中，缓冲溶液可采用常规方法进行制备，例如0.0lM PBS缓冲液的配制方法包括以下步骤:
[0070]1.组份浓度:137mM NaCl, 2.7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4 ；
[0071]2.配制量:IOOOmL ;
[0072]3.配制方法:
[0073]I)称量下列试剂，置于IL烧杯中；
[0074]NaC18g ；KC10.2g ；Na2HP04l.42g ；KH2PO40.27g
[0075]2)向烧杯中加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；[0076]3)滴加浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至IL;
[0077]4)高温高压灭菌后，室温保存。用时随取即可。
[0078]本发明稀释液中碱金属氯化物的含量优选为2?5g/L，更优选为3?4g/L。从而使得稀释液的电导率P保持在0.55X 104?0.75X 104yS/cm之间，保证了抗原抗体反应体系所需的最佳离子强度。一类优选的碱金属氯化物包括:NaCl、KCl或其组合。
[0079]由于本发明稀释液具有如上所述的电导率P、渗透压和pH值，因此对样本进行稀释时，稀释液可以维持抗原抗体所需的最佳反应条件，从而确保了血清或血浆样本中特种蛋白检测结果的准确度和精密度。
[0080]另外，本发明的稀释液还可以包括一种以上的乳化剂，以更好地提高检测的准确性。按稀释液的总重量计，乳化剂含量为0.08?0.10wt%，优选为0.09%。一类优选的乳化剂包括但不限于:脂肪醇聚氧乙烯醚。其中，脂肪醇聚氧乙烯醚包括异构十醇聚氧乙烯醚、异构十三醇聚氧乙烯醚等。
[0081]本文所述脂肪醇聚氧乙烯醚(AE)，又为聚乙氧基化脂肪醇，是由脂肪醇与环氧乙烷通过加成反应而制得，其通式为R-0-(C2H40)n-H，R为饱和或者不饱和的羟基，η是环氧乙烷的加成数，也就是乳化剂分子中氧乙烯基的数目。
[0082]异构十醇聚氧乙烯醚，即通式中的R为Cltl，其中优选为Ε1005，即R为Cltl且η=5 ；异构十三醇聚氧乙烯醚，即碳链R为C13，其中优选为Ε1304，即R为C13且η=4。
[0083]在不妨碍本发明效果的范围内，本发明的稀释液可含有适当量的选自下组的一种或多种组分:(a)金属离子螯合物；(b)碱金属硫酸盐；(c)防腐剂。
[0084]其中，按稀释液总重量计,金属离子螯合物的含量优选为0.05?0.08wt%,更优选为0.06?0.07wt%。一类优选的金属离子螯合物包括:EDTA、EDTA衍生物。其中，EDTA衍生物包括EDTA碱金属盐，如EDTA钠盐，以及乙二醇-双-(3-氨基-乙醚)N-N’ -四乙酸(EGTA)0优选EDTA钠盐。
[0085]按稀释液总重量计，防腐剂的含量优选为0.03?0.08wt%,更优选为0.03?0.05wt%，最佳地为0.04wt%。一类优选的防腐剂包括:叠氮钠、Proclin300、双咪唑烷基脲、异噻唑啉酮、1-羟基吡啶-2-硫酮、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯基酸乙酯、广谱杀菌剂(如四环素类，氯霉素，庆大霉素类)。
[0086]本发明的稀释液与现有的血液稀释剂存在以下区别:
[0087]现有的血液稀释剂检测的是全血样本，而本发明的稀释液用于检测血清或者血浆样本，而非全血样本。现有的血液稀释剂是用于检测全血中的血细胞，且主要针对于血细胞的计数和分类，测量血红蛋白参数以及区分白细胞亚型等；而本发明的稀释液是用于测定血清或者血浆中的特定蛋白的含量。
[0088]所述特定蛋白为能与抗体发生特异性结合的蛋白，包括:血清或血浆中的肿瘤标志物、激素和感染性疾病类的免疫学指标。
[0089]感染性疾病类的免疫学指标，也称传染性类的免疫学指标，例如乙肝表面抗原HBsAg,人类免疫缺陷病毒HIV，人乳头状瘤病毒HPV等。
[0090]本发明的稀释液可适用于进口自动免疫分析仪，包括(但不限于):美国雅培公司的AXSYM、强生公司的Vitros EC1、贝克曼-库尔特的DXI800、法国梅里埃Vidas系列、日本东曹 AIA 系列仪器(例如 AIA-2000ST、AIA-360、AIA-600I1、AIA-900、AIA-900M、AIA-900L、AIA-1800ST、AIA-2000LA 等)、罗氏 Modular EVO 免疫分析仪。
[0091]本发明稀释液的制备方法主要包括以下步骤:
[0092](I)将各组分进行混合，得一混合溶液；
[0093](2)调节所得混合溶液的pH值，即制得本发明的稀释液。
[0094]本发明的稀释液在制备时，各组分的添加顺序并无特别要求，只需充分混合溶解既可。一类优选的方法包括:
[0095](I)配制 0.01-0.2mol/L 缓冲溶液，pH 值为 6.0-8.0 ；
[0096](2)向步骤(I)的缓冲液中加入白蛋白，终浓度为30_90g/L，搅拌，使其充分溶解；
[0097](3)加入碱金属氯化物，终浓度为0.3_4g/L，搅拌，使其充分溶解；
[0098](4)加入金属离子螯合物，终浓度为0.05-0.08wt%,搅拌，使其充分溶解；
[0099](5)加入乳化剂，终浓度为0.08-0.10wt%,搅拌，使其充分混匀；
[0100](6)加入防腐剂，终浓度为0.03-0.05wt%,搅拌，使其充分溶解；
[0101](7)用5M氢氧化钠溶液或5M盐酸溶液调节pH值至7.2-7.8，混匀；
[0102](8)室温静置30min以上，2°C _8°C保存。
[0103]与现有技术相比，本发明的主要优点包括:
[0104](I)将本发明的稀释液用于检测血清或血浆样本中蛋白，其检测结果准确度高；
[0105](2)将本发明的稀释液用于检测血清或血浆样本中蛋白，其检测结果精密度高；
[0106](3)本发明的稀释液具有良好的热稳定性；
[0107](4)本发明的稀释液可长期稳定保存。
[0108]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0109]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0110]血清标本:本发明实施例中所使用的血清标本为糖类抗原CA19-9 (CarbohydrateAntigenl9_9)和人绒毛膜促性腺激素-β 亚基(human Chorionic Gonadotropin, β -HCG)的血清标本(由上海颛桥医院提供)。
[0111]参照样品:选自日本东曹免疫分析仪配套专用稀释液CA19-9样本稀释液(批号:1450770)和β-HCG样本稀释液(批号:C853591)。
[0112]在实施例和对比例中，均采用日本东曹AIA-2000ST型全自动免疫分析仪进行血清或血浆检测分析。
[0113]分别采用参照样品、对比例稀释液和实施例稀释液对不同浓度的糖类抗原CA19-9和β-HCG的血清标本进行倍比稀释，然后采用荧光磁微粒酶免法(具体方法参照文献“改良荧光磁微粒酶免分析法检测三种肿瘤标志物及应用，标记免疫分析与临床。2008，15(5):306?307转287”)进行测定，评价各稀释液的性能。
[0114]本发明以下实施例、对比例中的血清或血浆稀释液通过常规方法，将各组分进行混合来制备。
[0115]下列实施例与对比例中的终浓度均为按稀释液总重量计的质量百分数。
[0116]实施例1
[0117]稀释液中各组分与含量如表1所示:
[0118]表1
【权利要求】
1.一种血清或血浆样品稀释液，其特征在于，所述稀释液包括: (a)缓冲溶液； (b)白蛋白，所述白蛋白的含量为10?100g/L； (c)碱金属氯化物；以及 (d)任选的乳化剂； 并且所述稀释液的pH值为6.0?8.0。
2.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述白蛋白选自:血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白。
3.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述白蛋白的含量为30?90g/L。
4.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述缓冲溶液选自:磷酸缓冲溶液(PB)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl)或其组合。
5.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述碱金属氯化物的含量为2?5g/L。
6.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述乳化剂含量为0.08?0.10wt%,按稀释液的总重量计。
7.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述稀释液还包括选自下组的一种或多种组分: (a)金属离子螯合物； (b)碱金属硫酸盐； (C)防腐剂。
8.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述稀释液具有以下的一种或多种特性: (a)所述稀释液在室温下的电导率P为0.55 X IO4?0.75 X IO4 μ S/cm ； (b)所述稀释液为待测样本提供的渗透压为250?380m0sm/Kg； (c)所述稀释液的pH为7.2?7.8。
9.一种免疫分析方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的稀释液进行血清或血浆样品检测的步骤。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的稀释液。
【文档编号】G01N1/38GK103487313SQ201310496604
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】李子樵, 李亨芬 申请人:上海蓝怡科技有限公司