一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种家畜血液中糖皮质激素的检测方法。是一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法。先将色谱甲醇中加入纯度为100％的布地奈德异构体和白术内酯III，均匀混合后成对照品，布地奈德在对照品中的浓度R(+)为0.052～10.4μg/mL，S(-)为0.047～9.4μg/mL，白术内酯III在对照品中的浓度为8～12μg/mL。然后在干燥带塞离心管中加入作为内标物的白术内酯III甲醇溶液0.2mL，吹干离心管，将待测家畜血清0.2mL加入吹干后的离心管中，白术内酯III在甲醇溶液中的浓度等于白术内酯III在对照品中的浓度。用测定的结果可根据公式计算出血清中布地奈德含量。本发明可为人类的健康起到保障作用。
【专利说明】一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种家畜血液中糖皮质激素一布地奈德异构体的定量检测方法。
【背景技术】
[0002]布地奈德(Budesonide)为一种糖皮质激素类药物，临床研究发现布地奈德主要应用于呼吸系统疾病的治疗，效果确切。布地奈德跟硫酸特布他林联合治疗毛细支气管炎疗效显著；同时布地奈德与沙丁胺醇联合应用雾化吸入治疗慢性阻塞性肺病(COPD)较单一用药疗效确切，可明显提高患者生活质量。布地奈德与西替利嗪、氟美松可以早期干预支原体肺炎咳嗽症状。布地奈德雾化吸入对儿童咳嗽变异性哮喘具有明显的疗效。 [0003]糖皮质激素类药物也是目前兽医临床中应用最广泛的药物之一，为兽医临床上最有效的抗炎药物。不少基层兽医在日常的诊疗工作中积累了丰富的经验，形成了各自的用药体系。然而，由于各种原因，糖皮质激素药物正出现严重滥用的现象。据统计我国刚进入21世纪时糖皮质激素药物原料生产总量为150吨左右，其中地塞米松产量不到20吨，超过50 %用于出口。之后每年以超过前一年10 %的速度递增，至2007年受全国范围暴发高致病性蓝耳病的影响，全年产量一度达到300吨，其中以地塞米松产量增长最快，然而据我国农业部2008年公告，每年兽用地塞米松有很大一部分是不合理的滥用。盲目滥用此类药物引起药物残留，不仅对畜禽机体造成很大的伤害，还可以通过环境或食物链迁移，最终可能损害人类的自身健康。
[0004]糖皮质激素外用可降低毛细血管的通透性，减少渗出和细胞浸润，具有抗炎、抗过敏、抗休克、免疫抑制等多种作用，临床应用广泛。但长期接触糖皮质激素易导致皮肤变薄、发红、发痒，出现血糖升高、高血压、骨质疏松、胎儿畸形、免疫功能下降等副作用。短时间使用含糖皮质激素的化妆品可抑制皮肤发炎，恢复皮肤弹性，减少皱纹或治疗粉刺，促进毛发生长；但长期使用含有糖皮质激素的化妆品就可导致各种副作用，产生激素依赖性，甚至可导致癌症。近年来糖皮质激素药物滥用的现象越来越严重，引起的公共卫生事件使人们越来越意识到糖皮质激素药物滥用的危害性。滥用糖皮质激素药物不仅严重影响我国畜牧养殖业的发展，也对人类自身健康构成了威胁。因此我们应该采取有效措施减少糖皮质激素药物在我国畜牧养殖产业上的滥用，保证我国养殖业持续健康发展，提高生产经济效益，维护人类自身的生命安全。
[0005]现有的检测布地奈德的方法------高效液相色谱法，其具有测试结果准确的特
点；可是其存在着以下不足之处:
[0006]1.检测基质(原料药或制剂基质)较干净，杂质少，易于分离；而本研究为生物样品——动物血液中布地奈德检测,基质复杂。
[0007]2.流动相选用较复杂，酸性较强，对色谱柱不利。
[0008]3.大多采用外标法定量，难以保证检测方法的准确性；而本研究内标物选择较适中。
【发明内容】
[0009]本发明要解决的技术问题是提供一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法，采用该方法检测布地奈德异构体具有准确性高的优点。
[0010]为了解决上述技术问题，本发明提供一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法，包括以下步骤:
[0011]I)、在色谱甲醇中加入纯度为100%的布地奈德异构体和白术内酯III，均匀混合后成对照品；布地奈德在对照品中的浓度R(+)为0.052?10.4μ g/mL，S(-)为0.047?9.4 μ g/mL,白术内酯III在对照品中的浓度为8?12 μ g/mL ；
[0012]2)、在干燥带塞离心管中加入作为内标物的白术内酯III甲醇溶液0.2mL，吹干离心管，然后将待测家畜血清0.2mL加入吹干后的离心管中；白术内酯III在甲醇溶液中的浓度等于白术内酯III在对照品中的浓度；
[0013]3)、在上述步骤2)所得的离心管中加入4.5?5.5mL的提取试剂；
[0014]4)、将步骤3)所得的离心管振荡混匀后以4000?10000r/min进行离心，获取全部有机相；并对所获取的有机相进行干燥处理；
[0015]5)、将上述干燥处理后的有机相溶解于体积比=40:60的乙腈与水组成的0.2mL流动相中，15000?30000r/min离心后,获取液体层；
[0016]6)、将步骤I)所得的对照品和步骤5)所得的液体层分别进行高效液相色谱分析，检测条件如下:以体积比=40:60的乙腈与水作为流动相,流速0.5?1.0mL/min、进样量10?20 μ L、检测波长为240nm、色谱柱温度为30摄氏度；分别获得对照品以及液体层中布地奈德异构体与白术内酯III的吸收峰面积比；
[0017]7)、根据以下计算公式获得待测动物血清中布地奈德异构体的含量:
[0018]待测动物血清中布地奈德R(+)的含量=液体层中布地奈德R(+)与白术内酯III的吸收峰面积比X布地奈德R(+)在对照品中的浓度/对照品中布地奈德R(+)与白术内酯III的吸收峰面积比。
[0019]待测动物血清中布地奈德S(_)的含量=液体层中布地奈德S(_)与白术内酯III的吸收峰面积比X布地奈德s(-)在对照品中的浓度/对照品中布地奈德s(-)与白术内酯III的吸收峰面积比。
[0020]作为本发明的动物血清中布地奈德异构体的同时定量检测方法的改进:步骤3)中的提取试剂为乙酸乙酯。
[0021]作为本发明的动物血清中布地奈德异构体的定量检测方法的进一步改进:步骤2)中于40?50°C水浴中氮气流吹干离心管。
[0022]作为本发明的动物血清中布地奈德异构体的定量检测方法的进一步改进:步骤4)中离心后，去除液体层；然后于40?50°C水浴中氮气流吹干离心管，得干燥处理后的有机相。
[0023]作为本发明的动物血清中布地奈德异构体的定量检测方法的进一步改进:步骤I)中白术内酯III在对照品中的浓度为10μ g/mL，步骤3)中加入5mL的乙酸乙酯。
[0024]当待检动物血清时，采用本发明的方法能得知每mL待检血清中含有多少Ug的布地奈德异构体。本发明的动物血清中布地奈德异构体的定量检测方法，采用了高效液相色谱(HPLC)方法，因此能使检测限达到微克级，完全能够满足动物血液中的激素的检测要求。而且高效液相色谱(HPLC)方法具有分离和分析定量的功能，能够将血清中激素色谱峰和杂质干扰峰分离开，进行定量分析，能避免了血清中的杂质对检测结果的干扰，从而确保了检测结果的正确性。
[0025]为了证明本发明方法的正确性，发明人做了如下的对比实验:
[0026]选用一种已经确定不含布地奈德的动物血清，其色谱图如图2所示(色谱分析检测条件同本发明)。在该种化妆品中加入不同重量的布地奈德异构体，从而形成含有不同浓度布地奈德的待测样品。对上述待测样品分别用本发明的方法和分光光度计方法进行检测；结果如表1所述:
[0027]表1
[0028]
【权利要求】
1.一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法，其特征在于:在检测时，首先在色谱甲醇中加入纯度为100%的布地奈德异构体和白术内酯III，均匀混合后成对照品；布地奈德在对照品中的浓度R(+)为0.052?10.4μ g/mL，S(_)为0.047?9.4μ g/mL，白术内酯III在对照品中的浓度为8?12 μ g/mL，然后在干燥带塞离心管中加入作为内标物的白术内酯III甲醇溶液0.2mL，吹干离心管，然后将待测家畜血清0.2mL加入吹干后的离心管中；白术内酯III在甲醇溶液中的浓度等于白术内酯III在对照品中的浓度。
2.如权利要求1所述的一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法，其特征在于:所说的离心管中加入4.5?5.5mL的提取试剂，对所得的离心管振荡混匀后以4000?10000r/min进行离心，获取全部有机相，并对所获取的有机相进行干燥处理。
3.权利如要求2所述的一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法，其特征在于:将干燥处理后的有机相溶解于体积比=40:60的乙腈与水组成的0.2mL流动相中，15000?30000r/min离心后，获取液体层。
4.如权利要求1或3所述的一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法，其特征在于:将获取的液体层和对照品的液体分别进行高效液相色谱分析，检测条件如下:以体积比=40:60的乙腈与水作为流动相，流速0.5?1.0mL/min、进样量10?20 μ L、检测波长为240nm、色谱柱温度为30摄氏度，分别获得对照品以及液体层中布地奈德异构体与白术内酯III的吸收峰面积比。
5.如权利要求1所述的一种家畜血液中布地奈德异构体的定量检测方法，其特征在于:根据以下计算公式获得待测动物血清中布地奈德异构体的含量，待测动物血清中布地奈德R(+)的含量=液体层中布地奈德R(+)与白术内酯III的吸收峰面积比X布地奈德R(+)在对照品中的浓度/对照品中布地奈德R(+)与白术内酯III的吸收峰面积比，待测动物血清中布地奈德S(-)的含量=液体层中布地奈德S(-)与白术内酯III的吸收峰面积比X布地奈德S(-)在对照品中的浓度/对照品中布地奈德S(-)与白术内酯III的吸收峰面积比。
【文档编号】G01N30/02GK103616442SQ201310524887
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】徐爱春, 张雪梅, 葛建 申请人:中国计量学院