缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法
【专利摘要】本发明提供了缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，该方法包括以没食子酸为多酚类物质标准品绘制标准曲线、缺苞箭竹中多酚类物质的样品溶液制备及缺苞箭竹样品中多酚类物质含量的测定三个步骤，本发明提供的方法，检测限低、准确度高、重现性好、精密高。
【专利说明】缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析化学领域，尤其涉及福林酚法测定缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法。
【背景技术】
[0002]大熊猫被誉为“活化石”，为我国国家一级保护动物，是世界野生动物保护的旗舰物种，随着环境的改变和数千年的演化与适应，其逐渐转化为以亚高山竹类为主食的植食性动物，主食竹为缺苞箭竹。
[0003]大熊猫的主食竹中含有较高含量的多酚类物质，研究人员认为，植物多酚会对动物产生阻食和降低消化率的作用，因此，竹子中多酚类物质的含量会影响大熊猫的取食利用及采食量，但目前，科研人员对竹子中，尤其缺苞箭竹中多酚类物质含量的检测方法研究很少，尚未建立起对缺苞箭竹中多酚类物质的含量检测方法。
[0004]目前仅有对其它植物或药物制剂中多酚类物质含量检测方法的报道，如中国专利CN103076425A和中国专利CN102590435A中公开了一种破布木果的质量检测方法，采用福林酚-酚法测定破布木果中多酚的含量，但是不同的植物品种间细胞结构有所差别，而且多酚含量相差巨大，因此在不同的植物品种间多酚的提取方法、提取和检测条件也无相互借鉴价值。因此，对于大熊猫主食竹缺苞箭竹中多酚类物质的含量检测方法尚待建立。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明人经锐意研究，结果发现:缺苞箭竹粉末可被60?80%的乙醇溶液在60?80°C回流I?3小时的条件下提取出大量的多酚类物质而不会过量引入杂质；本发明人经探索，确定Na2CO3溶液浓度为5?15%，福林酚试剂与Na2CO3溶液体积比为1: 0.25?8，样品溶液与福林酚试剂的体积比为1: 0.5?10，I: 0.5?10，显色时间为5?30min,显色温度为10?45°C,检测波长为410?900nm的条件下,可以使溶液的吸光度值在0.1?0.8之间，并且，以没食子酸为标准品所做的标准曲线线性良好，相关系数R2 > 0.99，因此，本发明通过上述方法对大熊猫主食竹缺苞箭竹中多酚类物质进行提取并进行含量测定，再通过回归方程和稀释定律计算出缺苞箭竹中多酚类物质的含量，从而完成本发明。
[0006]本发明的目的在于提供以下几方面:
[0007]第一方面，本发明提供缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，包括:
[0008](I)以没食子酸为多酚类物质标准品绘制标准曲线:
[0009]配制浓度为80?120 μ g/mL的没食子酸标准溶液，以梯度体积量取上述没食子酸标准溶液，分别移至容量瓶内，配制成没食子酸系列标准溶液，按没食子酸系列标准溶液体与福林酚试剂积比1: 0.5?10向没食子酸系列标准溶液中分别加入等量的福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的没食子酸系列标准溶液中按福林酚试剂与Na2CO3溶液体积比1: 0.25~8分别加入等量的Na2CO3溶液，静置5~30分钟后用高纯水定容，配制成为标准曲线溶液，在显色温度为10~45°C的条件下，静置显色25~250分钟；用紫外-可见分光光度计在检测波长410~900nm测定标准曲线溶液的吸光度，并将测得的吸光度值绘制成为标准曲线，使其回归方程为一次函数，并且相关系数R2 > 0.99 ；
[0010]其中，
[0011 ] 所述Na2CO3溶液的重量分数为5~15% ；
[0012]所述高纯水为去离子水或二次蒸馏水；
[0013](2)缺苞箭竹中多酚类物质的样品溶液制备，包括以下子步骤:
[0014](2-1)将缺苞箭竹粉碎，过60~80目的筛子筛分，得到缺苞箭竹粉末；
[0015](2-2)称取(2-1)中制得的缺苞箭竹粉末，置于提取容器中，按重量比1: 10~30的比例加入重量分数为60~80%乙醇溶液)，在回流温度60~80°C下回流I~3小时；
[0016](2-3)将(2-2)中回流后的固液混合物，在转速为3000~5000r/min、温度为10~30°C的条件下，离心5~15分钟；
[0017](2-4)将(2-3)中离心后的固液混合物减压过滤，将滤液转移至容量瓶中，用高纯水定容，制备成为样品溶液，按样品溶液与福林酚试剂体积比1: 0.5~10向样品溶液中加入福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的样品溶液中按福林酚试剂与Na2CO3溶液体积比1: 0.25~8加入Na2CO3溶液，静置5~30分钟后用高纯水定容，在显色温度为10~45°C的条件下，静置显色25~250分钟配制缺苞箭竹样品待测溶液，待用；
[0018](3)缺苞箭竹样品中多酚类物质含量的测定:
[0019]用绘制标准曲线时使用的紫外-可见分光光度计测定(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的吸光度值，该吸光度值在标准曲线上所对应的浓度值即为缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度，即Cww,再通过下式换算出缺苞箭竹中多酚类物质的含量，即C
原样品，
[0020]C原样品=C稀释液X V稀释液/V原样品
[0021]其中，
[0022]Cww是指(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度；
[0023]Vw?是指(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的体积；
[0024]是指(2-4)中制备的样品溶液中多酚类物质的浓度；
[0025]Vbw品是指(2-4)中制备的样品溶液的体积。
[0026]第二方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(2-2)中，
[0027]所述缺苞箭竹粉末与乙醇溶液的重量比为1: 15~25;
[0028]所述乙醇溶液的重量分数为65~75% ；
[0029]所述回流温度为65~75°C ；
[0030]所述回流时间为1.5~2.5小时。
[0031]第三方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(2-2)中，
[0032]所述缺苞箭竹粉末与乙醇溶液的重量比为1: 20;
[0033]所述乙醇溶液的重量分数为70%。[0034]第四方面，本发明提供上述测缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法，其特征在于，步骤(2-3)中，
[0035]所述的转速为4000r/min ；
[0036]温度为25°C ；
[0037]离心时间为8?12分钟。
[0038]第五方面，本发明提供上述测缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法，其特征在于，所述Na2CO3溶液的重量分数为8?12%。
[0039]第六方面，本发明提供上述测缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法，其特征在于，所述福林酚试剂与Na2CO3溶液的体积比为1: 4?6。
[0040]第七方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述试样溶液与福林酚试剂的体积比为1: 2?6。
[0041]第八方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述多酚类物质含量的检测条件中显色温度为20?40°C。
[0042]第九方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述多酚类物质含量的检测条件中显色时间为60?150分钟。
[0043]第十方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(I)中所述检测波长为650?800nm。
[0044]本发明提供的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，具有如下有益效果:
[0045](I)本发明提供的方法，从缺苞箭竹中提取多酚类物质的步骤中所用的多酚类物质提取溶剂容易获得，提取方法简便，成本低；
[0046](2)本发明提供的缺苞箭竹中多酚类物质的检测方法，均能实现良好的准确度和重现性；
[0047](3)本发明提供的方法中所绘制的多酚类物质的标准曲线，具有稳定性和普适性，可使用该曲线进行多个样本的含量检测，有效的避免了重复性劳动，节约了时间和人工成本；
[0048](4)本发明提供的方法，检测限低，灵敏度高，能有效检测样品中较低浓度的多酚类物质的含量；
[0049](5)本发明提供的方法，精密度高，稳定性好，对缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定准确。
【具体实施方式】
[0050]以下通过【具体实施方式】进一步解释或说明本
【发明内容】
，但实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。
[0051]多酚类物质为酚类物质的一个重要类群，其特殊的化学结构导致其具有独特的生理活性和生态学意义，尤其在天然植物中，多酚类物质作为自我保护性次生代谢产物，对动物的摄食量具有重要意义。
[0052]植物中多酚类物质可与口腔内蛋白质以氢键或疏水键相结合，当口腔中多酚类物质含量较高时，口腔上皮细胞受到刺激而产生收缩、折皱等一系列复杂的变化，使其在被食用时产生不良的味觉，即涩味，降低食物的适口性；同时，多酚类物质能够降低动物的消化速率，并与动物肠道的外层细胞发生结合，降低肠壁的可透性，使动物大脑将其理解为“饱觉”，从而抑制动物对其的摄食量。
[0053]此外，多酚类物质能够与食物中的蛋白质相结合，形成不易消化的化合物，使蛋白质不容易被胃酸分解吸收，从而降低动物对蛋白质的利用率；同时，多酚类物质能够与动物消化道内的相应的消化酶，如纤维素酶，相结合，抑制酶活性从而阻碍动物对纤维素、淀粉和脂肪等的消化，进而导致动物的营养不良。
[0054]通常，在动物中不会发生多酚类物质中毒的情况，只会因为食物的口感差和厌食效应而减少对多酚类物质含量较高的食物的摄食量，但当动物食性较为单一，而其食物中多酚类物质含量过高时，就有产生中毒的可能，严重时可导致动物死亡。而“活化石” 一熊猫，我国国家一级保护动物，其食性就较为单一，其主食竹为缺苞箭竹，因此缺苞箭竹中多酚类物质的含量对熊猫的生存质量显得尤为重要，因此本发明建立了一种采用福林酚法测定缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法。
[0055]多酚类物质的分子上含有多个极易被氧化的羟基，福林酚试剂中的钨钥酸可以将多酚类物质上的羟基定量氧化，而其自身则被还原，在碱性条件下生成蓝色化合物，而且其颜色的深浅程度与原多酚类物质的含量呈正相关，并在一定条件下遵从Lambert-Beer定律，即，被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比，由此可以通过福林酚法测定缺苞箭竹中多酚类物质的总量。
[0056]没食子酸，是典型的多酚类物质，其结构如下所示，具有3个酚羟基，是一种结构简单的多酚类物质，其结构稳定，以没食子酸为标准品所做的标准曲线线性良好，相关系数R2 > 0.99，而且其线性范围在适宜缺苞箭竹中多酚类物质的含量检测，同时，没食子酸价廉易得，因此在本发明中选用没食子酸作为检测缺苞箭竹中多酚类物质的标准品。
[0057]
【权利要求】
1.缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，包括: (1)以没食子酸为多酚类物质标准品绘制标准曲线: 配制浓度为80~120 μ g/mL的没食子酸标准溶液，以梯度体积量取上述没食子酸标准溶液，分别移至容量瓶内，配制成没食子酸系列标准溶液，按没食子酸系列标准溶液与福林酚试剂体积比1: 0.5~10向没食子酸系列标准溶液中分别加入等量的福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的没食子酸系列标准溶液中按福林酚试剂与N%C03溶液体积比I: 0.25~8分别加入等量的Na2CO3溶液，静置5~30分钟后用高纯水定容，配制成为标准曲线溶液，在显色温度为10~45°C的条件下，静置显色25~250分钟；用紫外-可见分光光度计在检测波长410~900nm测定标准曲线溶液的吸光度，并将测得的吸光度值绘制成为标准曲线，使其回归方程为一次函数，并且相关系数R2 > 0.99 ； 其中， 所述Na2CO3溶液的重量分数为5~15% ； 所述高纯水为去离子水或二次蒸馏水； (2)缺苞箭竹中多酚类物质的样品溶液制备，包括以下子步骤: (2-1)将缺苞箭竹粉碎，过60~80目的筛子筛分，得到缺苞箭竹粉末； (2-2)称取(2-1)中制得的缺苞箭竹粉末，置于提取容器中，按重量比1: 10~30的比例加入重量分数为60~80%乙醇溶液，在回流温度60~80°C下回流1~3小时； (2-3)将(2-2)中回流后的固液混合物，在转速为3000~5000r/min、温度为10~30°C的条件下，离心5~15分钟； (2-4)将(2-3)中离心后的固液混合物减压过滤，将滤液转移至容量瓶中，用高纯水定容，制备成为样品溶液，按样品溶液与福林酚试剂体积比1: 0.5~10向样品溶液中加入福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的样品溶液中按福林酚试剂与Na2CO3溶液体积比1: 0.25~8加入Na2CO3溶液，静置5~30分钟后用高纯水定容，在显色温度为10~45°C的条件下，静置显色25~250分钟配制缺苞箭竹样品待测溶液，待用； (3)缺苞箭竹样品中多酚类物质含量的测定: 用绘制标准曲线时使用的紫外-可见分光光度计测定(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的吸光度值，该吸光度值在标准曲线上所对应的浓度值即为缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度，即C_?，再通过下式换算出缺苞箭竹中多酚类物质的含量，即Csti品， C原样品=C稀释液X V稀释液/V原样品； 其中， Cwfa是指(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度； Vwfa是指(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的体积； Cs#s是指(2-4)中制备的样品溶液中多酚类物质的浓度； V是指(2-4)中制备的样品溶液的体积。
2.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(2-2)中， 所述缺苞箭竹粉末与乙醇溶液的重量比为1: 15~25; 所述乙醇溶液的重量分数为65~75% ；所述回流温度为65~75°C ； 所述回流时间为1.5~2.5小时。
3.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(2-2)中， 所述缺苞箭竹粉末与乙醇溶液的重量比为1: 20; 所述乙醇溶液的重量分数为70%。
4.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(2-3)中， 所述的转速为4000r/min ； 温度为25°C ； 离心时间为8~12分钟。
5.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述Na2CO3溶液的重量分数为 8~12%。
6.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述福林酚试剂与Na2CO3溶液的体积比为1: 4~6。
7.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(I)中所述没食子酸系列标准溶液福林酚试剂的体积比为1: 2~6; 步骤(2-4)中所述样品溶液与福林酚试剂体积比为1: 2~6。
8.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述显色温度为20~40°C。
9.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述显色时间为60~150分钟。
10.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(!)中所述检测波长为650~800nm。
【文档编号】G01N21/78GK103558214SQ201310538431
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】赵莘, 段丽娟, 高健, 李洁, 李俊清 申请人:北京林业大学