双功能适配体检测试剂盒以及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种能够同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测的双功能适配体检测试剂盒以及检测方法。这种双功能适配体检测方法，在Hg2+和Ag+两种金属离子同时存在的情况下，会由于T-Hg2+-T与C-Ag+-C结构的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端的胸腺嘧啶的错配和胞嘧啶的错配分别形成连接，从而使得杂交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能够被扩增，被第一DNA切割酶的切割形成的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别与第一探针序列和第二探针序列杂交，从而导致第一探针序列和第二探针序列分别被第二DNA切割酶和第三DNA切割酶切割，最终第一荧光团和第二荧光团被暴露出来，通过荧光检测同时对在Hg2+和Ag+两种金属离子进行检测。
【专利说明】双功能适配体检测试剂盒以及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境分析和食品安全领域，特别是涉及一种能够同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测的双功能适配体检测试剂盒以及检测方法。
【背景技术】
[0002]汞和银是两种很常见的重金属，被广泛应用于制药，电池和摄影工业等领域。但当这些产品的副产物或在使用废弃后，部分重金属最终将以离子形式进入环境，对水体和土壤造成了严重的污染。汞离子对动植物和人体健康都有很大的影响，长期暴露在含汞离子的环境中会导致中枢神经系统以及其它器官的永久性的伤害。银离子的直接毒性相对较小，但它能够在水生生物中产生很强的富集作用，从而通过食物链的方式进入人体内，使之成为具有高危害的重金属元素之一。
[0003]现有的Hg2+和Ag+检测技术包括原子吸收光谱，ICP-MS，有机荧光分子和适配体法等。其中，原子吸收光谱法是传统的分析方法，测试时将样品通过适当的方法溶解，使所含的汞全部转化为Hg2+，然后用还原剂将Hg2+还原成汞蒸气，导入测汞仪中进行测定；ICP-MS法的样品前处理过程与原子吸收光谱类似，首先需要将样品中的汞溶解以转化成离子状态，经过消解作用后，将样品注入进质谱仪中进行测定；有机荧光分子法是通过化学合成的方法产生一种特殊基团，此基团能够特异性地与重金属离子发生反应，从而造成结构上的改变而增强或淬灭荧光，最后利用荧光强度的变化达到检测的目的。适配体法是近年发展了一种新方法，具有高灵敏度和特异性，其主要是利用胸腺嘧啶(T)与胞嘧啶(C)分别与Hg2+和Ag+形成两种特殊的配对结构，即T-Hg2+-T与C-Ag+-C,从而设计出相应的生物传感器来进行分析重金属离子。
[0004]适配体法以其灵敏度和特异性受到很多关注，通过复合结构发展了多种金属离子的分析方法，如荧光，电化学，比色和拉曼法等。但这些方法只能局限于检测一种金属离子(Hg2+或Ag+)，不能同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子的检测。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种能够同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测的双功能适配体检测试剂盒以及检测方法。
[0006]一种双功能适配体检测试剂盒，用于同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测，包括: [0007]第一模版DNA和第二模版DNA，所述第一模版DNA中含有与所述第二模版DNA互补配对的15个碱基，并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通过所述15个碱基形成杂交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶的错配和3个胞嘧啶的错配，所述胸腺嘧啶的错配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配对结构，从而使得杂交后的所述第一模版DNA的3’末端能够以所述第二模版DNA的5’端为模版扩增，所述胞嘧啶的错配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配对结构，从而使得杂交后的所述第二模版DNA的3’末端能够以所述第一模版DNA的5’端为模版扩增；
[0008]DNA聚合酶和第一 DNA切割酶，所述第一 DNA切割酶可以对扩增出来的所述第一模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶还可以对扩增出来的所述第二模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第二寡核苷酸；
[0009]第一荧光团淬灭团探针和第二荧光团淬灭团探针，所述第一荧光团淬灭团探针包括第一探针序列和结合在所述第一探针序列上的第一荧光团和第一淬灭团，所述第一探针序列可以与所述第一寡核苷酸杂交，所述第一荧光团和所述第一淬灭团发生淬灭反应，所述第二荧光团淬灭团探针包括第二探针序列和结合在所述第二探针序列上的第二荧光团和第二淬灭团，所述第二探针序列可以与所述第二寡核苷酸杂交，所述第二荧光团和所述第二淬灭团发生淬灭反应，所述第一荧光团和所述第二荧光团不同；
[0010]第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶和dNTPs，所述第二 DNA切割酶可以对杂交后的所述第一探针序列进行剪切并且剪切后所述第一荧光团和所述第一淬灭团分离，所述第三DNA切割酶可以对杂交后的所述第二探针序列进行剪切并且剪切后所述第二荧光团和所述第二淬灭团分离。
[0011 ] 在一个实施例中，所述第一模版DNA为SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA为SEQ ID N0.2所示的序列。
[0012]在一个实施例中，所述第一探针序列为SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探针序列为SEQ ID N0.4所示的序列。
[0013]在一个实施例中，所述第一荧光团为羧基荧光素，所述第二荧光团为四甲基罗丹明。
[0014]在一个实施例中，所述DNA聚合酶为DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BbvCI，所述第二 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶为DNA切割酶Nt.AlwI。
[0015]一种双功能适配体检测方法，用于同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测，包括如下步骤:
[0016]将待测样品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后发生杂交反应得到杂交液，其中，所述第一模版DNA中含有与所述第二模版DNA互补配对的15个碱基,并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通过所述15个碱基形成杂交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶的错配和3个胞嘧啶的错配；
[0017]向所述杂交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶发生寡核苷酸链置换扩增反应，得到寡核苷酸扩增液，其中，胸腺嘧啶的错配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配对结构，从而使得杂交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端为模版扩增，胞嘧啶的错配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配对结构，从而使得杂交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端为模版扩增，所述第一 DNA切割酶对扩增出来的所述第一模版DNA的5’端序列的·互补序列进行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶还对扩增出来的所述第二模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第二寡核苷酸；
[0018]向所述寡核苷酸扩增液中加入第一荧光团淬灭团探针、第二荧光团淬灭团探针、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶发生双功能荧光扩增反应，得到荧光检测液，其中，所述第一荧光团淬灭团探针包括第一探针序列和结合在所述第一探针序列上的第一荧光团和第一淬灭团，所述第一探针序列可以与所述第一寡核苷酸杂交，所述第一荧光团和所述第一淬灭团发生淬灭反应，所述第二荧光团淬灭团探针包括第二探针序列和结合在所述第二探针序列上的第二荧光团和第二淬灭团，所述第二探针序列可以与所述第二寡核苷酸杂交，所述第二荧光团和所述第二淬灭团发生淬灭反应，所述第一荧光团和所述第二荧光团不同，所述第二 DNA切割酶对杂交后的所述第一探针序列进行剪切并且剪切后所述第一荧光团和所述第一淬灭团分离，所述第三DNA切割酶对杂交后的所述第二探针序列进行剪切并且剪切后所述第二荧光团和所述第二淬灭团分离；
[0019]对所述荧光检测液进行荧光检测，完成所述双功能适配体检测方法。
[0020]在一个实施例中，所述第一模版DNA为SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA为SEQ ID N0.2所示的序列。
[0021]在一个实施例中，所述第一探针序列为SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探针序列为SEQ ID N0.4所示的序列。
[0022]在一个实施例中，所述DNA聚合酶为DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BbvCI，所述第二 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶为DNA切割酶Nt.AlwI。
[0023]在一个实施例中，向所述寡核苷酸扩增液中加入第一荧光团淬灭团探针、第二荧光团淬灭团探针、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶发生双功能荧光扩增反应的操作中，还需要向其中加入牛血清白蛋白。
[0024]这种双功能适配体检测方法，在Hg2+和Ag+两种金属离子同时存在的情况下，会由于T-Hg2+-T与C-Ag+-C结构的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶的错配和3个胞嘧啶的错配分别形成连接，从而使得杂交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能够被扩增，接着通过第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别与第一探针序列和第二探针序列杂交，从而导致第一探针序列和第二探`针序列分别被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最终第一荧光团和第二荧光团被暴露出来，通过检测荧光检测液的荧光，可以同时对在Hg2+和Ag+两种金属离子进行检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为一实施方式的双功能适配体检测方法的原理图；
[0026]图2为如图1所示的双功能适配体检测方法的流程图；
[0027]图3为寡核苷酸链置换扩增反应得到的寡核苷酸扩增液的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；
[0028]图4A为不同浓度Hg2+的荧光光谱曲线；
[0029]图4B为如图4A所示的荧光光谱曲线以520nm处的荧光强度作为纵坐标，Hg2+浓度的对数值的横坐标拟合曲线；
[0030]图5A为不同浓度Ag+的荧光光谱曲线；
[0031]图5B为如图5A所示的荧光光谱曲线以582nm处的荧光强度作为纵坐标，Ag+浓度的对数值的横坐标拟合曲线；[0032]图6为双功能适配体检测方法的特异性实验的荧光分析图。
【具体实施方式】
[0033]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0034]一实施方式的双功能适配体检测试剂盒，用于同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测，包括:
[0035]第一模版DNA、第二模版DNA、DNA聚合酶、第一 DNA切割酶、第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶、dNTPs、第一荧光团淬灭团探针和第二荧光团淬灭团探针。
[0036]第一模版DNA中含有与第二模版DNA互补配对的15个碱基,并且第一模版DNA和第二模版DNA通过该15个碱基形成杂交后第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶(T)的错配和3个胞嘧啶(C)的错配。
[0037]胸腺嘧啶(T)的错配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配对结构，从而使得杂交后的第一模版DNA的3’末端能够以第二模版DNA的5’端为模版扩增。当Hg2+不存在时，由于3个胸腺嘧啶(T)的错配形成阻断作用，从而使得杂交后的第一模版DNA的3’末端不能够以第二模版DNA的5’端为模版扩增。
[0038]胞嘧啶(C)的错配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配对结构，从而使得杂交后的第二模版DNA的3’末端能够以第一模版DNA的5’端为模版扩增。当Ag+不存在时，由于3个胞嘧啶(C)的错配形成阻断作用，从而使得杂交后的第二模版DNA的3’末端不能够以第一模版DNA的5’端为模版扩增。
[0039]第一 DNA切割酶可以对扩增出来的第一模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第一寡核苷酸，并且第一 DNA切割酶还可以对扩增出来的第二模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第二寡核苷酸。
[0040]第一荧光团淬灭团探针包括第一探针序列和结合在第一探针序列上的第一荧光团和第一淬灭团，第一探针序列可以与第一寡核苷酸杂交，第一荧光团和第一淬灭团发生淬灭反应。
[0041]第二荧光团淬灭团探针包括第二探针序列和结合在第二探针序列上的第二荧光团和第二淬灭团，第二探针序列可以与第二寡核苷酸杂交，第二荧光团和第二淬灭团发生淬灭反应。
[0042]本实施方式中，第一荧光团淬灭团探针和第二荧光团淬灭团探针由探针合成公司“宝生物工程(大连)”制作。
[0043]本实施方式中，第一荧光团为FAM (羧基荧光素)，第二荧光团为TAMRA (四甲基罗丹明X 第一淬灭团为 EclipseCEclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.),第二淬灭团为 Eclipse (Eclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.X
[0044]本实施方式中，第一突光团和第二突光团不同。
[0045]第二 DNA切割酶识别双链DNA，可以对杂交后的第一探针序列进行剪切并且剪切后第一突光团和第一淬灭团分离，从而第一突光团活化可以发出突光。[0046]第三DNA切割酶识别双链DNA，可以对杂交后的第二探针序列进行剪切并且剪切后第二荧光团和第二淬灭团分离，从而第二荧光团活化可以发出荧光。
[0047]这种双功能适配体检测试剂盒，在Hg2+和Ag+两种金属离子同时存在的情况下，会由于T-Hg2+-T与C-Ag+-C结构的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶的错配和3个胞嘧啶的错配分别形成连接，从而使得杂交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能够被扩增，接着通过第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别与第一探针序列和第二探针序列杂交，从而导致第一探针序列和第二探针序列分别被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最终第一荧光团和第二荧光团被暴露出来，通过荧光检测，可以同时对在Hg2+和Ag+两种金属离子进行检测。
[0048]本实施方式中，第一模版DNA为SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA为SEQ IDN0.2所示的序列。
[0049]本实施方式中，第一探针序列为SEQ ID N0.3所示的序列，第二探针序列为SEQ IDN0.4所示的序列。
[0050]DNA聚合酶可以为DNA聚合酶Klenow fragment，第一 DNA切割酶可以为DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶可以为DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶可以为DNA切割酶 Nt.AlwI。
[0051]下面结合图1和图2，提供一实施方式的采用上述双功能适配体检测试剂盒的一种双功能适配体检测方法，用于同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测，包括如下步骤:
[0052]S10、将待测样品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后发生杂交反应得到杂交液。
[0053]SlO中使用的缓冲液为第一反应缓冲液，其中，IOX第一反应缓冲液(0.2摩尔每升的三氨基甲烷醋酸，PH7.9,0.1摩尔每升的醋酸镁，0.5摩尔每升的醋酸钾，0.01摩尔每升的二硫苏糖醇)。`
[0054]第一模版DNA中含有与第二模版DNA互补配对的15个碱基,并且第一模版DNA和第二模版DNA通过15个碱基形成杂交后第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶的错配和3个胞嘧啶的错配。
[0055]本实施方式中，第一模版DNA为SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA为SEQ IDN0.2所示的序列。
[0056]S20、向SlO得到的杂交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶发生寡核苷酸链置换扩增反应，得到含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的寡核苷酸扩增液。
[0057]胸腺嘧啶(T)的错配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配对结构，从而使得杂交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端为模版扩增。当Hg2+不存在时，由于3个胸腺嘧啶(T)的错配形成阻断作用，从而使得杂交后的第一模版DNA的3’末端不能够以第二模版DNA的5’端为模版扩增。
[0058]胞嘧啶(C)的错配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配对结构，从而使得杂交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端为模版扩增。当Ag+不存在时，由于3个胞嘧啶(C)的错配形成阻断作用，从而使得杂交后的第二模版DNA的3’末端不能够以第一模版DNA的5’端为模版扩增。
[0059]第一 DNA切割酶对扩增出来的第一模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第一寡核苷酸，并且第一 DNA切割酶还对扩增出来的第二模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第二寡核苷酸。
[0060]S30、向S20得到的寡核苷酸扩增液中加入第一荧光团淬灭团探针、第二荧光团淬灭团探针、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶发生双功能荧光扩增反应，得到荧光检测液。
[0061]S30中使用的缓冲液为第二反应缓冲液，其中，IOX第二反应缓冲液(0.1摩尔每升的三氨基甲烷盐酸，PH7.9,0.1摩尔每升的氯化镁，0.5摩尔每升的氯化钠，0.01摩尔每升的二硫苏糖醇)。
[0062]一般而言，S30中进行双功能荧光扩增反应时，还需要加入牛血清白蛋白。
[0063]牛血清白蛋白的作用是为了辅助第二 DNA切割酶。
[0064]第一荧光团淬灭团探针包括第一探针序列和结合在第一探针序列上的第一荧光团和第一淬灭团，第一探针序列可以与第一寡核苷酸杂交，第一荧光团和第一淬灭团发生淬灭反应。
[0065]第二荧光团淬灭团探针包括第二探针序列和结合在第二探针序列上的第二荧光团和第二淬灭团，第二探针序列可以与第二寡核苷酸杂交 ，第二荧光团和第二淬灭团发生淬灭反应。
[0066]本实施方式中，第一突光团和第二突光团不同。
[0067]本实施方式中，第一荧光团淬灭团探针和第二荧光团淬灭团探针由探针合成公司“宝生物工程(大连)”制作。
[0068]本实施方式中，第一荧光团为FAM (羧基荧光素)，第二荧光团为TAMRA (四甲基罗丹明X 第一淬灭团为 EclipseCEclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.),第二淬灭团为 Eclipse (Eclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.X
[0069]第二 DNA切割酶识别双链DNA，可以对杂交后的第一探针序列进行剪切并且剪切后第一突光团和第一淬灭团分离，从而第一突光团活化可以发出突光。
[0070]第三DNA切割酶识别双链DNA，可以对杂交后的第二探针序列进行剪切并且剪切后第二荧光团和第二淬灭团分离，从而第二荧光团活化可以发出荧光。
[0071]本实施方式中，第一探针序列为SEQ ID N0.3所示的序列，第二探针序列为SEQ IDN0.4所示的序列。
[0072]DNA聚合酶可以为DNA聚合酶Klenow fragment，第一 DNA切割酶可以为DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶可以为DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶可以为DNA切割酶 Nt.AlwI。
[0073]S40、对S30得到的荧光检测液进行荧光检测，完成双功能适配体检测方法。
[0074]由于第一突光团和第二突光团不同，第一突光团和第二突光团活化后发出的突光也不同。
[0075]通过对荧光检测液进行荧光检测，分析具体检测得到的荧光波长和荧光强度，可以对Hg2+和Ag+两种金属离子进行定性和定量分析。
[0076]这种双功能适配体检测方法，在Hg2+和Ag+两种金属离子同时存在的情况下，会由于T-Hg2+-T与C-Ag+-C结构的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶的错配和3个胞嘧啶的错配分别形成连接，从而使得杂交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能够被扩增，接着通过第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别与第一探针序列和第二探针序列杂交，从而导致第一探针序列和第二探针序列分别被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最终第一荧光团和第二荧光团被暴露出来，通过检测荧光检测液的荧光，可以同时对在Hg2+和Ag+两种金属离子进行检测。
[0077]这种双功能适配体检测方法还具有如下优点:
[0078]扩增效率高，通过将两步双功能扩增方式串联起来，大大提高了扩增效率，极大地提闻了检测灵敏度；
[0079]特异性强，通过T-Hg2+-T与C-Ag+-C结构，大大增强了检测的特异性；
[0080]适用于实际样品检测，在实际样品检测时不需要复杂的前处理步骤，而且在自来水样检测中未发现任何的基质干扰效应，在实测中具有良好的应用前景。
[0081]下面为具体实施例。实施例中第一模版DNA为SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA为SEQ ID N0.2所示的序列，第一探针序列为SEQ ID N0.3所示的序列，第二探针序列为SEQ ID N0.4所不的序列，DNA聚合酶为DNA聚合酶Klenow fragment,第一 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶为DNA切割酶Nt.AlwI，第一荧光团淬灭团探针和第二荧光团淬灭团探针由探针合成公司“宝生物工程(大连)”制作，第一荧光团为FAM，第二荧光团为TAMRA。第一淬灭团为Eclipse，第二淬灭团为Eclipse。
[0082]实施例1
[0083]试剂准备:分别准备以下浓度的试剂:1微摩尔每升的第一模版DNA，I微摩尔每升的第二模版DNA，2.5毫摩尔每升的dNTPs (四种脱氧核糖核苷酸的混合物)，IOX第一反应缓冲液(0.2摩尔每升的三氨基甲烷醋酸，pH7.9，0.1摩尔每升的醋酸镁，0.5摩尔每升的醋酸钾，0.01摩尔每升的二硫苏糖醇)，IOX反应缓冲液2 (0.1摩尔每升的三氨基甲烷盐酸，PH7.9,0.1摩尔每升的氯化镁，0.5摩尔每升的氯化钠，0.01摩尔每升的二硫苏糖醇)，10单位每微升的DNA切割酶Nb.BbvC1、Nb.BtsI和Nt.AlwI，5单位每微升DNA聚合酶Klenowfragment (3，-5’ exo_), 100XBSA(牛血清蛋白，10mg/mL), 100微摩尔每升的第一突光团淬灭团探针(QF probe-Ι)和第二荧光团淬灭团探针(QF probe-2)，无菌水以及不同浓度的汞离子和银离子。
[0084]双功能扩增反应:将反应溶液分为A液、B液、C液和D液，总体积为50微升。其中A液包含0.25微升第一模版DNA、0.25微升第二模版DNA、I微升dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的混合物)、1微升IOX第一反应缓冲液、I微升目标金属离子(Hg2+或Ag+)和6微升无菌水；B液包含0.3 微升DNA切割酶Nb.BbvCI>0.2 微升DNA聚合酶Klenow fragment (3’-5’exo_)；C液包含0.125微升QF probe-Ι和0.3微升QF probe-2,5微升IOX第二反应缓冲液、33.875微升(或33.7微升)的无菌水；D液包含0.5微升DNA切割酶Nb.BtsI和I微升DNA切割酶Nt.AlwI以及0.5微升BSA (牛血清蛋白，10mg/mL)。A液首先在95°C下孵育3分钟，然后冷却至37°C，再加入B液，使二者在37°C下反应60分钟，再与C液混合后于37°C下反应15分钟，接着加入D液在37°C下反应45分钟，最后可通过荧光仪收集信号。
[0085]扩增原理结合图1:第一步是第一模版DNA和第二模版DNA发生杂交反应，两者之间有15个碱基互补，但是在3端处各有三个碱基错配，分别是三个胸腺嘧啶和三个胞嘧啶。第二步是寡核苷酸链置换·扩增反应，当加入Hg2+和Ag+时，模板链3端的错配碱基发生结合，形成T-Hg2+-T与C-Ag+-C的复合结构，这就为扩增反应提供了条件。如果不存在Hg2+和Ag+，则会由于3端的错配导致扩增反应不能启动。此后，在DNA聚合酶Klenowfragment (3’ -5’ exo_)和dNTPs (四种脱氧核糖核苷酸的混合物)的作用下，以第一模版DNA和第二模版DNA为扩增模板进行延伸，从而形成完整的双链结构。随后DNA切割酶Nb.BbvCI识别双链结构的切刻酶识别位点(该切刻酶仅识别双链结构)，并在该位点的下游第2个碱基处对新合成链进行切刻，这就产生了新的聚合酶复制位点。该位点可由聚合酶Klenow fragment (3? -5’ exo_)再次延伸，同时其链置换活力可将切刻后的下游寡核苷酸片段置换出来，而再次延伸后的序列又可被切刻酶Nb.BbvCI切刻，继而再被聚合酶Klenowfragment (3’ -5’ exo_)延伸，这种反复的延伸和切刻循环即构成了链置换扩增反应,它能够扩增产生大量的短的寡核苷酸片段。而且，此种双功能模板能够同时产生两种不同序列的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。第三步是双功能荧光扩增反应，产生的寡核苷酸片段可分别同QF probe-Ι和QF probe-2探针 杂交结合。由于形成的双链含有相应的识别位点，能够分别被切刻酶Nb.BtsI和Nt.AlwI切割，导致QF probe-Ι和QF probe-2探针被切割成两段，使得荧光团与淬灭团发生分离，从而产生强的荧光信号。此时寡核苷酸片段又能从双链结构中分离出来，与新的未被切断的QF probe探针结合,这样就形成了一个切割-分离-杂交的循环中，荧光信号得到很大程度的增强。而且QF probe-Ι和QF ριχΛθ_2探针具有不同的荧光团，所以能够产生不同发射波长的荧光，进而达到双功能荧光扩增的目的。
[0086]实施例2
[0087]寡核苷酸链置换扩增反应验证实验.。
[0088]采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析对寡核苷酸链置换扩增反应进行验证。
[0089]其结果如图3所示，在不存在Hg2+和Ag+的情况下，即对照管电泳道(control道)未发现任何扩增的条带；在仅存在Hg2+或Ag+的情况下，在其电泳道的20bp往下处能够发现明显的寡核苷酸目标条带，这说明链取代扩增反应已经成功实现。在同时存在Hg2+和Ag+的情况下，寡核苷酸目标条带也能够明显的被观察到，而且其条带明显比单独存在一种金属离子时要亮，这说明在两种金属离子同时存在下时，成功扩增出两种不同的寡核苷酸。总之，整个双功能链取代扩增反应能够很好地区分目标信号与对照信号，可行性非常好。
[0090]灵敏度实验。
[0091]通过不同浓度的Hg2+和Ag+进行了检测分析，验证测试方法的灵敏度，结果如图4A、图4B、图5A和图5B所示。图4A显示了不同浓度Hg2+的荧光光谱曲线，表明该技术方案对不同浓度的Hg2+具有很好的区分度。为了评估其定量分析能力，我们采用520nm处的荧光强度作为纵坐标，Hg2+浓度的对数值为横坐标拟合曲线，得到图4B。图4B呈现出良好的线性关系，其线性方程为F=-43.32+110.881og10C (相关系数为0.9958)，经过计算，该技术方案的检测限可达到1.93皮摩尔每升。
[0092]图5A显示的是不同浓度Ag+的荧光光谱曲线，从图中可以看出不同浓度下的荧光曲线具有很明显的区分度。为了定量分析研究，我们采用582nm处的荧光强度为纵坐标，Ag+浓度的对数值为横坐标拟合曲线，得到图5B。图5B表现出良好的线性关系，其线性方程为F=-63.56+91.331og10C (相关系数为0.9967)，经过计算，该技术方案的检测限可达到15.80
皮摩尔每升。
[0093]因此这种测试方法在Hg2+和Ag+方面都具有很高的检测灵敏度。[0094]特异性实验和实际水样分析。
[0095]为了评估Hg2+和Ag+的特异性，选用了 7种其他金属离子(Cu2+，Ca2+，Cd2+，Fe3+，Pb2+，Mn2+，Zn2+)进行了检测分析，检测结果如图6所示。
[0096]由图6可以看出，在Hg2+和Ag+处具有强的荧光信号，而另外七种金属离子则只具有微弱的荧光强度，表明该技术方案的特异性非常好。
[0097]此外，采用该检测方法应用于实际水样的检测，该实际样本为自来水。结果如表1所示。
[0098]
【权利要求】
1.一种双功能适配体检测试剂盒，用于同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测，其特征在于，包括: 第一模版DNA和第二模版DNA，所述第一模版DNA中含有与所述第二模版DNA互补配对的15个碱基，并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通过所述15个碱基形成杂交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶的错配和3个胞嘧啶的错配，所述胸腺嘧啶的错配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配对结构，从而使得杂交后的所述第一模版DNA的3’末端能够以所述第二模版DNA的5’端为模版扩增，所述胞嘧啶的错配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配对结构，从而使得杂交后的所述第二模版DNA的3’末端能够以所述第一模版DNA的5’端为模版扩增； DNA聚合酶和第一 DNA切割酶，所述第一 DNA切割酶可以对扩增出来的所述第一模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶还可以对扩增出来的所述第二模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第二寡核苷酸； 第一荧光团淬灭团探针和第二荧光团淬灭团探针，所述第一荧光团淬灭团探针包括第一探针序列和结合在所述第一探针序列上的第一荧光团和第一淬灭团，所述第一探针序列可以与所述第一寡核苷酸杂交，所述第一荧光团和所述第一淬灭团发生淬灭反应，所述第二荧光团淬灭团探针包括第二探针序列和结合在所述第二探针序列上的第二荧光团和第二淬灭团，所述第二探针序列可以与所述第二寡核苷酸杂交，所述第二荧光团和所述第二淬灭团发生淬灭反应，所述第一荧光团和所述第二荧光团不同； 第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶和dNTPs，所述第二 DNA切割酶可以对杂交后的所述第一探针序列进行剪切并且剪切后所述第一荧光团和所述第一淬灭团分离，所述第三DNA切割酶可以对杂交后的所述第二探针序列进行剪切并且剪切后所述第二荧光团和所述第二淬灭团分离。
2.根据权利要求1所述的`双功能适配体检测试剂盒，其特征在于，所述第一模版DNA为SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA为SEQ ID N0.2所示的序列。
3.根据权利要求1所述的双功能适配体检测试剂盒，其特征在于，所述第一探针序列为SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探针序列为SEQ ID N0.4所示的序列。
4.根据权利要求1所述的双功能适配体检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光团为羧基荧光素，所述第二荧光团为四甲基罗丹明。
5.根据权利要求1所述的双功能适配体检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BbvCI,所述第二 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶为DNA切割酶Nt.AlwI。
6.一种双功能适配体检测方法，用于同时进行Hg2+和Ag+两种金属离子检测，其特征在于，包括如下步骤: 将待测样品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后发生杂交反应得到杂交液，其中，所述第一模版DNA中含有与所述第二模版DNA互补配对的15个碱基,并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通过所述15个碱基形成杂交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分别形成3个胸腺嘧啶的错配和3个胞嘧啶的错配； 向所述杂交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶发生寡核苷酸链置换扩增反应，得到寡核苷酸扩增液，其中，胸腺嘧啶的错配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配对结构，从而使得杂交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端为模版扩增，胞嘧啶的错配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配对结构，从而使得杂交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端为模版扩增，所述第一 DNA切割酶对扩增出来的所述第一模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶还对扩增出来的所述第二模版DNA的5’端序列的互补序列进行剪切形成第二寡核苷酸； 向所述寡核苷酸扩增液中加入第一荧光团淬灭团探针、第二荧光团淬灭团探针、第二DNA切割酶和第三DNA切割酶发生双功能荧光扩增反应，得到荧光检测液，其中，所述第一荧光团淬灭团探针包括第一探针序列和结合在所述第一探针序列上的第一荧光团和第一淬灭团，所述第一探针序列可以与所述第一寡核苷酸杂交，所述第一荧光团和所述第一淬灭团发生淬灭反应，所述第二荧光团淬灭团探针包括第二探针序列和结合在所述第二探针序列上的第二荧光团和第二淬灭团，所述第二探针序列可以与所述第二寡核苷酸杂交，所述第二荧光团和所述第二淬灭团发生淬灭反应，所述第一荧光团和所述第二荧光团不同，所述第二 DNA切割酶对杂交后的所述第一探针序列进行剪切并且剪切后所述第一荧光团和所述第一淬灭团分离，所述第三DNA切割酶对杂交后的所述第二探针序列进行剪切并且剪切后所述第二荧光团和所述第二淬灭团分离； 对所述荧光检测液进行荧光检测，完成所述双功能适配体检测方法。
7.根据权利要求6所述的双功能适配体检测方法，其特征在于，所述第一模版DNA为SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA为SEQ ID N0.2所示的序列。
8.根据权利要求6所述的双功能适配体检测方法，其特征在于，所述第一探针序列为SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探针序列为SEQ ID N0.4所示的序列。
9.根据权利要求6所述的双功能适配体检检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为DNA聚合酶Klenow frag ment,所述第一 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BbvCI,所述第二 DNA切割酶为DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶为DNA切割酶Nt.AlwI。
10.根据权利要求6所述的双功能适配体检检测方法，其特征在于，向所述寡核苷酸扩增液中加入第一荧光团淬灭团探针、第二荧光团淬灭团探针、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶发生双功能荧光扩增反应的操作中，还需要向其中加入牛血清白蛋白。
【文档编号】G01N21/64GK103667448SQ201310542874
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】张春阳, 朱桂池 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院