一种以金属离子为标记的多目标dna生物传感器的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法。该方法首次提出以金属离子为标记物构建DNA生物传感器，以金属硫蛋白（MT）为桥梁实现金属离子与DNA检测探针序列的连接。首先，通过金属硫蛋白分别将Zn2+，Cd2+和Pb2+标记在三种病毒DNA片段的检测探针上，然后将此标记的检测探针与相应的固定在金基底上的DNA捕捉探针和样品中的目标DNA杂交，形成三明治结构，最后用盐酸将金属离子解离下来，用阳极溶出伏安法对金属离子进行检测，从而达到检测目标DNA的目的。本发明的传感器能够同时检测多种目标DNA，且具有灵敏度高，检测限低的特点。
【专利说明】—种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]铋膜电极对重金属离子(如Cu+、Zn2+、Cd2+、Pb2+等)具有优异的电化学响应。与汞电极相似，在还原电位作用下，铋离子与重金属离子可被还原成合金，此合金可被重新氧化成金属离子，在电极上表现出尖锐且对称的氧化信号。与汞电极相比，铋是一种环境友好材料，近年来受到科学家们的青睐。研究表明，铋膜电极不仅能对不同的重金属离子进行同时检测，而且检测限较低。然而，用金属离子作为探针DNA的标记物尚未见报道。
[0004]金属硫蛋白(MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。MT富含巯基，通常，每一个MT分子能结合7个二价金属离子或12个单价金属离子。而且，MT能结合多种金属离子，如Cu+、Ag+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Fe2+等等。MT与金属离子的结合是一个质子竞争反应，在碱性条件下，MT能与金属离子结合，而在酸性条件下，MT与金属离子的结合位点被质子占据，从而释放出金属离子。另一方面，金属饱和的金属硫蛋白仍有部分未反应的巯基，可用于进一步的交联反应。
[0005]4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂。其中，NHS活性酯是氨基活性基团，在pH 7?9的环境下与氨基反应生成酰胺键；马来酰亚胺是巯基活性基团，在pH
6.5?7.5的环境下与巯基反应生成稳定的硫醚键，因此，SMCC可以分别将含有巯基和氨基的化合物键接在一起。因此，只要对探针DNA序列进行末端氨基修饰，就能利用SMCC将其与含巯基的金属化的MT交联起来，生成金属离子标记的DNA检测探针。
【发明内容】
[0006]基于上述，本发明的目的在于提供一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器。
[0007]本发明的目的是这样实现的:
a.金属硫蛋白(MT)的金属化
称取金属硫蛋白冻干粉置入小烧杯中，用0.02 M、pH为8.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl )缓冲溶液溶解，再加入100摩尔当量的二硫苏糖醇，在N2保护下室温搅拌Ih，搅拌完毕后，用HCl或HClCV决速将溶液的pH调至1.0，再通过超过滤的方式用0.05 MHCl或0.1 M HClO4反复洗涤以除去解离下来的金属离子，得到纯化的金属硫蛋白，保存于4°C冰箱中，备用；再从冰箱中移取三份纯化金属硫蛋白溶液于小烧杯中，分别加入8摩尔当量的Zn2+，Cd2+、Pb2+，在N2保护下剧烈搅拌20 min后，滴加0.5 M三羟甲基氨基甲烷将金属硫蛋白溶液调至相应的PH值，温下继续搅拌I h，过量的金属离子通过超过滤的方式除去，得到锌-金属硫蛋白、镉-金属硫蛋白、铅-金属硫蛋白；
b.金属化的金属硫蛋白与NH2-DNA的交联反应
将交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)溶解于二甲基亚砜中，保存于4 °C冰箱中，备用，使用前稀释溶液，使二甲基亚砜的最终浓度为5%，锌-金属硫蛋白、镉-金属硫蛋白和铅-金属硫蛋白分别与40摩尔当量的交联剂和NH2-DNA在室温下反应I h，交联反应在pH 7.4的0.1 M磷酸氢二钠/磷酸二氢钠(PBS)溶液中进行，反应完毕后，未反应的交联剂和NH2-DNA通过超过滤的方式除去，制得Zn2+，Cd2+、Pb2+金属离子标记的检测探针；
c.杂交过程
将含捕捉探针DNA的TE溶液滴到金基底上，将金基底放置于封闭的塑料盒里；过夜后，用超纯水淋洗金基底，然后插入0.1 mM己硫醇(MCH)溶液中培养2 h，接着用超纯水彻底淋洗金基底，再将金基底浸入200 μ L含有Zn2+，Cd2+和Pb2+金属离子标记的检测探针DNA和相应的目标DNA的溶液中杂交，令其在水浴60 °C中培养5 min后，自然冷却至室温?’杂交完成后，将金基底浸于100 ULlM HCl中，保持10 min，使检测探针上的金属离子释放下来，待测。
[0008]d.方波阳极溶出伏安法检测金属离子
将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经浓度为95 %的乙醇、超纯水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极。插入含有ImM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、钼丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸的玻碳电极进行表征；再将玻碳电极取出用超纯水冲洗并吹干，备·用；将三电极体系插入含有Bi3+和待测金属离子的0.1 M、pH 4.5的乙酸缓冲溶液中，开启搅拌，在一 1.4 V的作用下用方波伏安法电沉积120 S，将Bi3+和待测金属离子原位共沉积到玻碳电极上，形成含有待测金属的铋膜。以一 1.3 V为初始电位，一 0.3 V为末电位，频率20 Hz，振幅25 mV，跃阶电势5 mV，静止时间10 S，进行方波阳极溶出伏安扫描；
e.采用origin软件作图，绘制步骤d所得的方波阳极溶出伏安曲线和峰电流与目标DNA浓度的线性关系图。
[0009]本发明优点和产生的有益效果是:
1、与以量子点为标记物的多目标DNA传感器相比，本发明研制的以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器，具有制备简单省时、响应快等优点。这主要是由于金属硫蛋白对金属离子具有高的亲和性，在碱性条件下，两者的结合是一个快速反应。与量子点相比，大大节省了检测探针的制备时间。另一方面，铋是一种环境友好材料，其对Zn2+、Cd2+、Pb2+具有优异的电化学响应，而且铋膜电极能对多种金属离子同时进行检测，从而实现对人类肠道病毒71型(EV71)目标DNA、人类疱疹病毒3型(HHV-3)目标DNA和口蹄疫病毒(FMDV)目标DNA同时进行检测。
[0010]2、本发明研制的以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器对目标DNA的检测具有线性范围宽，检测限低，选择性好，检测过程简单，灵敏度高及快速简便的优点，有很好的应用前景。【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1 不同浓度 0.1，0.4，0.6，0.8，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 ηΜ 的人类肠道病毒 71
型(EV71)目标DNA杂交后的标记物(Zn2+)在铋膜电极上的SWASV图，插图为Zn的氧化峰电流与EV71目标DNA浓度的线性关系图。
[0012]图2 不同浓度 0.1，0.4，0.6，0.8，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 ηΜ 的人类疱疹病毒 3 型
(HHV-3)目标DNA杂交后的标记物(Cd2+)在铋膜电极上的SWASV图，插图为Cd的氧化峰电流与HHV-3目标DNA浓度的线性关系图。
[0013]图3 不同浓度 0.1,0.4,0.6,0.8，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 ηΜ 的口蹄疫病毒(FMDV)目标DNA杂交后的标记物(Pb2+)在铋膜电极上的SWASV图，插图为Pb的氧化峰电流与FMDV目标DNA浓度的线性关系图。
[0014]图 4 不同浓度 0.1，0.4，0.6，0.8，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 ηΜ 的 EV71 目标 DNA、HHV-3目标DNA和FMDV目标DNA同时杂交后的标记物(Zn2+、Cd2+和Pb2+)在铋膜电极上的SffASV图，插图为Zn、Cd和Pb的氧化峰电流与相对应的目标DNA浓度的线性关系图。
【具体实施方式】
[0015]本发明实施过程中所使用的仪器和试剂:
CHI 660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)用于进行方波阳极溶出伏安和循环伏安的实验。电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)用于称量药品。超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)用于超声清洗电极。三氧化二铝打磨粉(0.30μηι ,0.05 μ?，上海辰华仪器试剂公司)用于`处理玻碳电极。Ag/AgCl为参比电极，钼丝为对电极。金属硫蛋白(纯度大于99%，大连联合博泰生物技术有限公司)，4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(Pierce)，二硫苏糖醇、己硫醇(Aladdin)，氯化铋(上海试剂总厂第二分厂)，硫酸锌、氯化镉、硝酸铅、二甲基亚砜、乙酸、乙酸钠、高氯酸、盐酸、三羟甲基氨基甲烷(北京化学试剂厂)。
[0016]实验过程中所用的DNA购于上海生工生物工程公司，其序列如下:
人类肠道病毒71型(EV71) DNA片段:
捕捉探针(C1): 5' -CAGACACTGTTGGTA- (CH2) 6_SH_3'
检测探针(d): 5' -H2N-(CH2)6-GAATAGCGTCAGAAT-3;
目标(t): 5' -TACCAACAGTGTCTGATTCTGACGCTATTC-3'
人类疱疹病毒3型(HHV-3) DNA片段:
捕捉探针(c2): 5' -GCTAAAACACGCGGC- (CH2) 6-SH_3'
检测探针(d2): 5' -H2N-(CH2)6-GTGACATCGCTATGT-3;
目标(t2): 5' -GCCGCGTGTTTTAGCACATAGCGATGTCAC-3'
口蹄疫病毒(FMDV) DNA片段:
捕捉探针(c3): 5' -TGCATCTGGTTAATG- (CH2) 6-SH_3'
检测探针(d3): 5' -H2N-(CH2)6-GTTGACATGTCCTCC-3;
目标(t3): 5' -CATTAACCAGATGCAGGAGGACATGTCAAC-3
下面，结合附图对本发明的技术方案再作进一步的说明:
一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法，包括以下步骤: a.金属硫蛋白(MT)的金属化
称取0.5 mg金属硫蛋白(MT)冻干粉置入小烧杯中，用I mL浓度为0.02 M、pH为8.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液溶解，再加入100摩尔当量的二硫苏糖醇，在N2保护下室温搅拌I h。搅拌完毕后，用HCl (适用于制备Zn-MT和Cd-MT)或HClO4 (适用于制备Pb-MT)快速将上述溶液的pH调至1.0，再通过3 KD、2 mL超滤管过滤的方式用浓度为0.05 M HCl或浓度为0.1M HClO4反复洗涤以除去解离下来的金属离子，得到纯化的MT(apo-MT)，保存于4°C冰箱中，备用。然后从冰箱中移取三份mL 0.2 mg/mL的apo_MT溶液于小烧杯中，分别在小烧杯中加入8摩尔当量的Zn2+、Cd2+、Pb2+金属离子，在N2保护下剧烈搅拌20 min后，滴加0.5 M Tris，将金属硫蛋白溶液调至相应的pH值(Zn-MT pH 7.4，Cd-MT pH 8.6，Pb-MT pH 7.6)，室温下继续搅拌I h。过量的金属离子通过超过滤的方式除去，得到金属化的MT (Zn-MT、Cd-MT、Pb-MT)。
[0017]b.金属化的MT与NH2-DNA的交联反应
将0.5 mg交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)溶解于1.3 mL 二甲基亚砜中，保存于4 °C冰箱中，备用，使用前稀释溶液，使二甲基亚砜的最终浓度为5%，Zn-MT、Cd-MT, Pb-MT分别与40摩尔当量的交联剂和NH2-DNA在室温下反应I h。为防止交联剂的水解，交联反应在pH 7.4的0.1 M NaH2P04/Na2HP04溶液中进行。反应完毕后，未反应的交联剂和NH2-DNA通过超过滤的方式除去，制得Zn2+，Cd2+、Pb2+金属离子标记的检测探针。
[0018]c.杂交过程
将5 μ L含2 μ M捕捉探针DNA的TE溶液(10 mM Tris-HCl + I mM EDTA)滴到金基底上，为防止溶液蒸发，将金基底放置于封闭的塑料盒里。过夜后，用超纯水淋洗金基底，然后插入0.1 mM MCH溶液中培养2 h，接着用超纯水彻底淋洗金基底，将捕捉探针修饰的金基底浸入200 μ L含有步骤b所制的Zn2+，Cd2+和Pb2+标记的检测探针DNA和相对应的不同浓度 0.1，0.4，0.6，0.8，I，2，3，4，5，6，7，8，9，10 ηΜ 目标 DNA 的溶液中，水浴 60 °C 中培养5 min后，令其自然冷却至室温。杂交完成后，将金基底浸于100 μ L I M HCl中，保持10min，使检测探针上的金属离子释放下来，待测。
[0019]d.方波阳极溶出伏安法(SWASV)检测金属离子
将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经浓度为95 %的乙醇、超纯水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极。插入含有ImM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、钼丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸的玻碳电极进行表征；再将玻碳电极取出用超纯水冲洗并吹干，备用。将三电极体系插入含有Bi3+和不同浓度的待测金属离子的0.1 M、pH 4.5的乙酸缓冲溶液中，开启搅拌，在一 1.4 V的作用下用方波伏安法电沉积120 S，将Bi3+和待测金属离子原位共沉积到玻碳电极上。以一 1.3 V为初始电位，一 0.3 V为末电位，频率20 Hz，振幅25 mV，跃阶电势5 mV，静止时间10 S，进行方波阳极溶出伏安扫描。
[0020]e.采用origin软件作图，绘制步骤d所得的方波阳极溶出伏安曲线和峰电流与目标DNA浓度的线性关系图。
[0021]为了说明以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的检测性能。图1是浓度分别为 0.1,0.4,0.6,0.8,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ηΜ 的人类肠道病毒 71 型(EV71)目标 DNA杂交后的标记物(Zn2+)在铋膜电极上的SWASV图，其中插图为Zn的氧化电流与目标DNA浓度的线性关系。图中一 1.13 V处尖锐的氧化锋是Zn的阳极溶出氧化峰，其峰电流的大小与目标DNA的浓度呈良好的线性关系，其检测线性范围为0.1-10 ηΜ，检测限为33 ρΜ。
[0022]图2 是检测浓度分别为 0.1，0.4，0.6，0.8，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 ηΜ 的人类疱疹病毒3型(HHV-3) DNA片段(以Cd2+为标记)时Cd2+的SWASV图。其中插图为Cd的氧化电流与目标DNA浓度的线性关系。图中一 0.78 V处尖锐的氧化锋是Cd的阳极溶出氧化峰，其峰电流的大小与目标DNA的浓度呈良好的线性关系，其检测线性范围为0.1-10 ηΜ，检测限为33 ρΜ。
[0023] 图3 是检测浓度分别为 0.1,0.4,0.6,0.8,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ηΜ 的口蹄疫病毒(FMDV) DNA片段(以Pb2+为标记)时Pb2+的SWASV图，其中插图为Pb的氧化电流与目标DNA浓度的线性关系。图中一 0.52 V处尖锐的氧化锋是Pb的阳极溶出氧化峰，其峰电流的大小与目标DNA的浓度呈良好的线性关系，其检测线性范围为0.1-10 ηΜ，检测限为33 ρΜ。
[0024]从图1、图2和图3中可以看出，分别用Zn2+、Cd2+和Pb2+标记的DNA传感器对于单独检测不同的病毒DNA片段均有检测限低、线性范围宽的特点，且在同浓度下，不同标记物的SWASV峰电流相似，这给同时检测多种不同病毒DNA片段带来可能。
[0025]为了考察该DNA传感器是否能用于同时检测多种不同病毒DNA片段，图4为同时检测三种不同浓度的病毒DNA片段时标记物(Zn2+、Cd2+和Pb2+)的SWASV图，其中插图为标记物的氧化电流与相对应目标DNA浓度的线性关系。从图中可以看出，三种病毒DNA片段的标记物在铋膜电极上的氧化峰分离较好，无重叠，峰电位分别为一 1.13 V (Zn)、一 0.78V (Cd)和一0.52 V (Pb)，相对应于标记物(Zn2+、Cd2+和Pb2+)的SffASV峰电位。此响应证明标记物(Zn2+、Cd2+和Pb2+)在铋膜电极上的响应是各自独立发生的，它们的氧化电流是随着各自的浓度变化而变化的，且呈线性关系。因此，该传感器可用于同时检测多种不同病毒DNA片段，标记物峰电流的大小与目标DNA的浓度呈良好的线性关系，其检测线性范围为
0.1-10NM。
【权利要求】
1.一种以金属离子为标记的多目标DNA生物传感器的制备方法，其步骤是: a.金属硫蛋白的金属化 称取金属硫蛋白冻干粉置入小烧杯中，用0.02 M、pH为8.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液溶解，再加入100摩尔当量的二硫苏糖醇，在N2保护下室温搅拌I h，搅拌完毕后，用HCl或HClCV决速将溶液的pH调至1.0，再通过超过滤的方式用0.05 M HCl或0.1M HClO4反复洗涤以除去解离下来的金属离子，得到纯化的金属硫蛋白，保存于4°C冰箱中，备用；再从冰箱中移取三份纯化金属硫蛋白溶液于小烧杯中，分别加入8摩尔当量的Zn2+，Cd2+、Pb2+，在N2保护下剧烈搅拌20 min后，滴加0.5 M三羟甲基氨基甲烷将金属硫蛋白溶液调至相应的PH值，室温下继续搅拌I h，过量的金属离子通过超过滤的方式除去，得到锌-金属硫蛋白、镉-金属硫蛋白、铅-金属硫蛋白； b.金属化的金属硫蛋白与NH2-DNA的交联反应 将交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶解于二甲基亚砜中，保存于4 1:冰箱中，备用，使用前稀释溶液，使二甲基亚砜的最终浓度为5%，锌-金属硫蛋白、镉-金属硫蛋白、铅-金属硫蛋白分别与40摩尔当量的交联剂和NH2-DNA在室温下反应I h,交联反应在pH 7.4的0.1 M磷酸氢二钠/磷酸二氢钠溶液中进行,反应完毕后，未反应的交联剂和NH2-DNA通过超过滤的方式除去，制得Zn2+，Cd2+、Pb2+金属离子标记的检测探针； c.杂交过程 将含捕捉探针DNA的TE溶液滴到金基底上，将金基底放置于封闭的塑料盒里；过夜后，用超纯水淋洗金基底，然后插入0.1 mM己硫醇溶液中培养2 h,接着用超纯水彻底淋洗金基底，再将金基底浸入200 μ L含有Zn2+，Cd2+、Pb2+金属离子标记的检测探针DNA和相应的目标DNA的溶液中杂交，令其在水浴60 °C中培养5 min后，自然冷却至室温；杂交完成后，将金基底浸于100 u L I M HCl中，保持10 min，使检测探针上的金属尚子释放下来，待测； d.方波阳极溶出伏安法检测金属离子 将玻碳电极依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经浓度为95 %的乙醇、超纯水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极，插入含有ImM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、钼丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸的玻碳电极进行表征；再将玻碳电极取出用超纯水冲洗并吹干，备用；将三电极体系插入含有Bi3+和待测金属离子的0.1 M、pH.4.5的乙酸缓冲溶液中，开启搅拌，在一 1.4 V的作用下用方波伏安法电沉积120 S，将Bi3+和待测金属离子原位共沉积到玻碳电极上，形成含有待测金属的铋膜，以一 1.3 V为初始电位，一 0.3 V为末电位，频率20 Hz，振幅25 mV，跃阶电势5 mV，静止时间10 S，进行方波阳极溶出伏安扫描； e.采用origin软件作图，绘制步骤d所得的方波阳极溶出伏安曲线和峰电流与目标DNA浓度的线性关系图。
【文档编号】G01N27/48GK103592355SQ201310558380
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】刘秀辉, 郑李纯, 刘元香, 汪维维 申请人:西北师范大学