一种以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是：取0.5～3.5mL的待测样品置于开口容器中，按1：1的体积比加入质量百分比浓度为65%～68%的浓硝酸，振荡混匀；所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；将混合液加热至沸腾，振荡驱酸，蒸发至近干，再加入纯水溶解，无损失的转移到10mL容量瓶中，最后加入水定容至刻度线；采用分光光度法或/和原子吸收光谱法测定容量瓶中水溶液中的钴含量。本发明通过对待测样品酸化处理，避免了微生物培养基成分对钴测定干扰大的缺点，同时还不会引入其他杂质，具有操作简便、快速、准确及灵敏等优点，能成功应用于微生物培养体系中钴含量的测定。
【专利说明】一种以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于测定钴含量的方法，涉及一种以酸化处理法测定微生物培养体系中钴 含量的方法。特别适用于浓硝酸硝化法测定LB (即Luria-Bertani)或NA (即Nutrient Agar)培养基中钴离子含量的方法。
【背景技术】
[0002]钴在土壤、水、空气及动植物等环境中广泛存在。钴是人体和植物所必须的微量元 素之一。在人体内钴主要通过形成维生素B12发挥生物学作用及生理功能，此外钴对铁的代 谢、血红蛋白合成和细胞发育等均有重要生理功能。
[0003]天然水中钴含量很低，浓度多数为0.01?1.00mg/L，这样的浓度对人动植物不会 产生毒害作用。有色金属冶炼厂和加工厂等企业的废水中常含高浓度的钴，例如:铅锌加工 厂废水钴的浓度可达0.5?1.0mg/L,制备次氯酸盐的工厂废水钴浓度可达1.3mg/L。水中 钴的浓度为0.1?0.27mg/L时，对西红柿等植物产生毒害作用，硫酸钴浓度为2.0mg/L可 使农作物生长减缓，甚至枯萎。研究钴污染环境的修复技术一直未间断过，而微生物活体修 复技术以其投资小、运行费用低、无二次污染等优点引起了广泛关注。因此，找到一种简便 又快捷的测定微生物培养体系中钴离子含量的方法，具有重要意义。
[0004]现有技术中，检测钴的方法主要有分光光度法、原子吸收光谱法、极谱法、高效液 相色谱法、化学发光法、电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法等，其中 分光光度法具有设备简单、操作方便、价格低廉且准确度和精密度都较高等优点，被广泛使 用。
[0005]现有技术中，微生物有4种常用培养体系:LB (即Luria-Bertani)培养基、NA ( SP Nutrient Agar)培养基、淀粉酪素培养基和查氏培养基。研究发现:LB培养基和NA培养基 会显著干扰钴离子的测定，影响率分别达24.20%和8.47%。采用现有技术方式难以实现微 生物培养基中钴含量的准确测定。
【发明内容】
[0006]本发明的目的旨在克服现有技术中的不足，提供一种以酸化处理法测定微生物培 养体系中钴含量的方法。本发明通过浓硝酸酸化样品以消除微生物常用培养基对钴测定的 显著影响，实现微生物培养体系中钴的准确测定。
[0007]本发明的内容是:一种以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特 征是包括下列步骤:
a、浓硝酸酸化处理待测样品:取0.5?3.5mL的待测样品置于开口容器(例如:小烧杯) 中，按1:1的体积比加入质量百分比浓度为65%?68%的浓硝酸，振荡混匀，得混合液；
所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；
b、将混合液置于备有石棉网的电炉上加热至沸腾，一边振荡一边驱酸，直到蒸发至近 干(混合液中的水蒸发99%以上)，再加入1.0?5.0mL纯水溶解，得水溶液；C、将水溶液无损失的转移到IOmL容量瓶中，最后用纯水定容至刻度线； d、采用分光光度法或/和原子吸收光谱法测定容量瓶中水溶液中的钴含量:
(I)采用分光光度法的测定方法是:取1.0mL容量瓶中水溶液于25mL比色管中，然后分别加入8.0mL柠檬酸铵-氨水缓冲液和3.0mL苦氨酸偶氮变色酸,用纯水定容至刻度线； 摇匀静置15min，于464nm测定吸光度，根据标准曲线即可求得相应浓度；
步骤a中所述待测溶液(pH约为7)经预处理(即上述步骤a、b和c)后，其pH降低至2 左右，而钴离子的络合显色是在一定的缓冲液中(pH=10.2)进行的，这必然会影响测定；研究发现通过调节预处理后溶液的PH并不能消除这种影响，而控制缓冲液的用量则可解决； 因此曾选用了 5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL、9.0mT, > 10.0mT,.11 ? OmT,.12.0mT,.13.0mT,.14.0mT, 和15.0mL的缓冲液对预处理后的待测液进行测定，以缓冲液体积(mL)为横坐标，钴离子吸光度A为纵坐标，结果如附图1;从图1中可知，缓冲液用量在8.0~10.0mL范围内，钴离子的吸光度基本保持稳定；因此本方法选用8.0mL缓冲液。 [0008](2)原子吸收光谱法:可采用AA700型原子吸收光谱仪测定。
[0009]本发明的内容中:步骤a中所述微生物培养体系是LB (即Luria-Bertani)或NA (即 Nutrient Agar)培养基；
微生物培养基中含有大量的多肽和氮基酸类物质。氨基酸的R基含有苯环共轭双键系统，与钴发生了某种螯合反应影响了钴的测定。本发明方法中选用浓硝酸酸化样品，其作用是将待测液中被培养基所螯合的钴再次释放为游离的钴离子，从而利于钴离子的测定。因此浓硝酸的用量会直接影响钴的回收率。为此曾采用待测溶液与浓硝酸(质量百分比浓度为65%~68%)的体积比为4:1、2:1、1: 1、1:2和1:3进行比较试验，结果表明4:1和2:1的体积比使钴的回收率分别达到88.17%和89.27%，而体积比大于1:1时回收率皆可超过95%， 满足了要求，因此本方法采用了 1:1的比例。
[0010]本发明的内容中:步骤a中所述微生物培养体系中钴含量低于100.00mg/L。
[0011]本发明的内容中:
1、所用的试剂及配置:
(1)浓硝酸(质量百分比浓度为65%~68%)；
(2)柠檬酸铵-氨水缓冲液:
每IOOmL溶液中含30mL质量百分比浓度为50%的柠檬酸铵水溶液和20 mL浓氨水(质量百分比浓度为25%~28%)，纯水定容。
[0012](3)0.2g/L苦氨酸偶氮变色酸:
上海长科试剂研究所金圣化工有限公司生产；准确称取0.050g苦氨酸偶氮变色酸于小烧杯中，用少量纯水溶解，无损失的转移至250 mL容量瓶中，纯水定容至刻度线，配制好后可以放置半个月。
[0013](4)钴储备液:5.00g/L (以钴含量计)
将六水合氯化钴(分析纯)在220°C下干燥24h得到无水氯化钴，冷却至室温。将精确称取的5.5080g无水氯化钴溶于少量纯水中，无损失的转移至500mL容量瓶中。
[0014](5) 50.00 mg/L 钴标准溶液:
由5.00g/L钴储备液稀释得到。
[0015](6) LB液体培养基和NA液体培养基(临时配制并灭菌):LB培养基(/L):由酵母粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，加纯水定容至1000mL组成，调节 pH=7.2 ~7.4 ;
NA培养基(/L):由牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，加纯水定容至1000mL组成，调节 pH=7.0。
[0016]2、所用的装置:
(1)7200型可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；
(2)电子万用炉(北京市永光明医疗仪器厂)；
(3)AA700 型原子吸收光谱仪(美国 PE 公司 PerkinElmer Instrument C0.U.S.A.)。
[0017]3、钴标准曲线的绘制:
按表1所示，吸取50.00 mg/L钴标准溶液(水溶液)分别置于15个25mL比色管中，然后分别加入8.0mL柠檬酸铵-氨水缓冲液和3.0mL苦氨酸偶氮变色酸,用纯水定容至刻度线，摇匀放置15min。在波长464nm处用Icm比色皿以试剂空白为参比测吸光度。
[0018]表1:钴标准曲线数据表:
【权利要求】
1.一种以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是包括下列步骤:a、浓硝酸酸化处理待测样品:取0.5?3.5mL的待测样品置于开口容器中，按1:1的体 积比加入质量百分比浓度为65%?68%的浓硝酸，振荡混匀，得混合液；所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；b、将混合液置于备有石棉网的电炉上加热至沸腾，一边振荡一边驱酸，直到蒸发至近 干，再加入1.0?5.0mL水溶解,得水溶液；C、将水溶液无损失的转移到10.0mL容量瓶中，最后加入水定容至刻度线；d、采用分光光度法和原子吸收光谱法测定容量瓶中水溶液中的钴含量。
2.按权利要求1所述以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是: 步骤a中所述微生物培养体系是LB或NA培养基。
3.按权利要求1或2所述以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征 是:步骤b和c中所述加入的水是纯水。
4.按权利要求1或2所述以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征 是:步骤a中所述微生物培养体系中钴含量低于100mg/L。
5.按权利要求3所述以酸化处理法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是: 步骤a中所述微生物培养体系中钴含量低于100mg/L。
【文档编号】G01N21/31GK103575677SQ201310560342
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】陈晓明, 张娥, 罗学刚, 张建国, 宋收, 郝希超, 王丹, 唐运来 申请人:西南科技大学