一种灰飞虱有机磷杀虫剂抗性快速检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测灰飞虱有机磷杀虫剂抗性的方法，属于生物【技术领域】。以硝酸纤维素膜为载体，利用酯酶催化α-乙酸萘酯形成萘酯，再与固蓝RR盐发生耦联反应，产生有色物质，然后根据颜色的深浅判断样本是否对有机磷杀虫剂产生抗性。该方法包括硝酸纤维素膜、PH7.5磷酸缓冲液、PH6.0磷酸缓冲液、染色液等试剂。其优点是(1)快速，可以在1小时内完成样本检测；(2)操作简单，且对操作人员要求较低，无需特定的仪器设备，一般人员简单培训后即可操作；(3)灵敏性更高，与靶标抗性分子检测技术相比，可以检测出较低水平的非靶标突变抗性。
【专利说明】一种灰飞虱有机磷杀虫剂抗性快速检测方法
一、【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及利用硝酸纤维素膜和3种溶液快速检测灰飞虱对有机磷杀虫剂的抗性。
二、技术背景
[0002]灰飞風Laodelphax striatellus FallSn是我国重要水稻害虫之一,在所有稻区均有发生。除以成虫、若虫直接刺吸危害水稻、小麦外,还传播水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病等多种植物病毒病，其传毒危害造成的损失巨大，严重时甚至颗粒无收，治虫防病成为挽回损失的主要手段。
[0003]灰飞虱的防治一直以化学农药为主，有机磷农药是害虫防治中常用的一类农药。我国灰飞風防治最常用的有机磷农药为毒死蝶。毒死蝶(英文通用名称Chlorpyrifos,化学分子式C9H11C13N03PS)属于胆碱酯酶抑制剂，是一种高效、广谱、安全的有机磷杀虫、杀螨剂。具有良好的触杀、胃毒和熏蒸作用以及强内吸性和高杀虫活性，可防治多种害虫，与常规有机磷农药相比毒性低，使用安全，是农业部推荐的用于灰飞虱防治的主要药剂之一。但是由于生物对逆境具有一定的进化适应性，抗药性的产生是杀虫剂使用的必然代价。抗性检测表明浙江省嘉兴、宁波和湖州地区，江苏省通州、楚州、大丰、南京和苏州地区灰飞虱对毒死蜱产生了低水平抗性。江苏省句容、建湖和武进地区、安徽庐江、福建福州和广东广州等地灰飞虱对毒死蜱产生了中等水平的抗性。抗性机理研究结果证实酯酶活性上升是促进灰飞虱对机磷杀虫剂产生抗性的重要因子。
[0004]抗性水平的监测是制定综合防治措施，有效治理害虫的先决条件。有3种方法可以检测害虫对杀虫剂是否产生抗性，即生测法、生化法和分子检测法。生测法为传统的抗性检测方法，该方法可以得到害虫对杀虫剂的抗性倍数，但是存在两方面的问题。一是所需时间长，完成整个生测需要2-5天，但是害虫发育较快，一般2天即可发育到下一龄期，因此在得到生测结果后有可能错过最佳防治时期。二是需要花费大量的人力。分子检测法源于分子生物学的发展，该方法要求明确杀虫剂抗性靶标基因和相关突变，对非靶标抗性难以检测，而害虫抗性发展的一般规律是先产生代谢抗性，然后再产生靶标抗性，因此靶标抗性一般与高水平抗性有关，在产生低水平抗性时，其靶标基因突变频率极低，难以检测。生化法根据害虫抗性产生机理，测定相关代谢酶的活性，从而判断害虫是否产生抗性，可以检测较低水平的抗性。传统生化检测，需要在田间收集试虫，然后在室内用酶标仪测定，因此对检测人员在技术上有一定的要求。本发明即源于该方法，但是借鉴了酶联免疫法的优点，采用硝酸纤维素膜为载体，可以快速简单地检测试虫是否对有机磷杀虫剂产生抗性，对操作人员要求低。
[0005]2、技术方案
[0006]为达到快速简单检测有机磷杀虫剂抗性的目的，本发明借鉴酶联免疫斑点法的优点，将酯酶固定在硝酸纤维素膜上，然后通过染色和漂洗，根据染色后斑点的颜色判断灰飞虱是否对有机磷杀虫剂产生抗性，具有快速简单的优势。[0007]本发明为一种快速检测灰飞虱有机磷杀虫剂抗性的方法，由硝酸纤维素膜、磷酸缓冲液、染色液等组成。
[0008]3、有益效果
[0009]本发明与现有技术相比，可以产生以下效果:
[0010](I)快速:生物测定方法测定试虫对杀虫剂的抗性一般需要48-120小时才能得到结果，而该方法只需要I小时即可判断试虫对有机磷杀虫剂是否产生抗性。
[0011](2)操作简单，且对操作人员要求低:不管是传统的生测法、生化法还是分子检测法都要求操作人员有相关的专业背景，需要受过相关的专业培训，而且相关检测工作较繁琐并需要有相应的仪器设备。而本发明只需适量硝酸纤维素膜，再配合3种不同的溶液即可完成对样本的检测，因此操作简单，对操作人员的专业素质要求较低，只需简单培训，就能进行相关检测工作。
[0012](3)灵敏性高:与分子检测技术相比可以检测更低水平的抗性。
四、【具体实施方式】
[0013]试剂:
[0014]溶液A:PH7.5磷酸钠缓冲液。
[0015]溶液B:PH6.0磷酸钠缓冲液。
[0016]溶液C: α -乙酸萘酯、固蓝RR盐溶于ΡΗ6.0磷酸钠缓冲液。
[0017]硝酸纤维素膜
[0018]酯酶活性检测:
[0019]取试虫置于离心管中，然后加入溶液Α，匀浆棒研磨均匀。取0.5μ I酶液，滴在硝酸纤维素膜上，晾干。然后将晾干后的硝酸纤维膜浸在溶液C中5min，取出膜，用溶液B漂洗2min，取出后即观察颜色，以敏感品系为标准，比较斑点颜色的深浅判断试虫是否产生抗性。
[0020]实施例1:
[0021]取毒死蜱抗性试虫5头，研磨后，将酶液等比例稀释，共6个浓度，然后进行染色。结果如附图1。根据该结果可知硝酸纤维素膜染色的深浅与酯酶的含量呈正比。
[0022]实施例2:
[0023]取毒死蜱抗性和敏感品系单头灰飞虱，研磨后染色，结果见附图2。根据该结果可知抗性品系4个体具有较高的酯酶活性，I个体酯酶活性略低，而敏感品系所有个体酯酶活性均较低，由此推断抗性品系中抗性个体频率为80%左右。
五、【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1利用本方法检测不同浓度酯酶。
[0025]图2利用本方法检测毒死蜱抗性和敏感试虫的酯酶。
[0026]在图1中，以、2乂、4乂、8乂、16乂、32乂分别表示原始酶液以及原始酶液稀释2倍、4倍、8倍、16倍和32倍；CK表示清水对照
[0027]在图2中，“敏感”示该行检测的5个样本取自敏感品系；“抗性”示该行5个样本取自毒死蜱抗性品系。
【权利要求】
1.一种对灰飞虱有机磷杀虫剂抗性快速检测的方法，其特征是以硝酸纤维素膜为载体，比较样本与敏感品系酯酶斑点的颜色，根据颜色的深浅来判断样本是否产生抗性。操作时将少量酶液固定于硝酸纤维素膜上后通过与底物α-乙酸萘酯反应，产生萘酯，然后与固蓝RR盐耦联，形成有色偶氮染料，从而在硝酸纤维素膜上显出颜色。然后根据颜色的深浅来判断样本是否产生抗性。
【文档编号】G01N33/544GK103558375SQ201310570981
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】王利华, 罗光华, 张月亮, 姚静, 方继朝 申请人:江苏省农业科学院