一种利用聚苯乙烯结合肽和单链抗体制备胶乳试剂的方法
【专利摘要】本发明提供一种利用聚苯乙烯结合肽能特异吸附在聚苯乙烯微球表面的特性，融合表达scFV和聚苯乙烯结合肽来使单链抗体定向固定在聚苯乙烯微球表面，从而制备出性能更特异，抗体立体结构更完整，亲和力更高，干扰因素更少的胶乳免疫比浊检测试剂盒的方法。
【专利说明】一种利用聚苯乙烯结合肽和单链抗体制备胶乳试剂的方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及免疫比浊的检测方法，尤其涉及到单链抗体定向固定到聚苯乙烯微球 表面技术所介导的单链抗体制备胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的开发。 【背景技术】
[0002]胶乳颗粒增强免疫比池法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay， PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，在高分子 胶乳微球的表面交联特异性抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速 聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能，反应液散光性能或透光性能（即吸光 度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。 PETIA检测是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定，抗原抗体反应后可直接 测定反应液的吸光度值，省去ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得 结果，省时省力。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足以检测到健康人血液中 许多标志蛋白的下限值，而且可用于自动化仪器检测。但是由于传统的胶乳增强免疫比浊 法本身的一些劣势，造成了其在灵敏性、试验成本、抗干扰方面都不尽如人意。
[〇〇〇3]目前国内的胶乳增强免疫比浊试剂采用物理被动吸附或化学偶联的方式进行包 被。其中被动吸附这种包被方法是非特异性的，存在吸附量少且易受蛋白质分子量、等电 点、浓度等因素的影响。同时当抗体的功能域结构相下或是侧面与载体表面结合时，不利于 抗体-抗原的结合，甚至完全失去结合抗体的能力。这种结合本身也不牢固，抗体容易脱落 或活性降低，造成试剂灵敏性、重复性及稳定性明显降低。化学偶联法抗体不容易脱落，试 剂稳定性增加，但是其固定的非特异性也会造成抗体的失活，影响试剂性能。
[0004] 目前免疫比浊试剂大多采用羊、鼠、兔等来源的单或多克隆抗体作为识别单位，但 是由于人血内异嗜性抗体的存在，可以非特异的结合抗体中的Fc结构域以及Fab片段中的 非抗原结合结构域，造成检测结果的假阳性，会误导医生对病情的判断。特别针对一些含量 较低的蛋白的检测，这种影响的比例能达到10%，同时也很难通过别的技术手段完全消除 影响。
[0005] 以上的缺点限制了胶乳增强免疫比浊法的应用。因此开发出特异性更强、稳定性 更好、灵敏度更高、抗干扰能力更强的免疫比浊类产品仍是临床诊断领域需要解决的重要 问题。
[〇〇〇6] 为了解决之上问题，我们选用了单链抗体（ScFv)作为免疫比浊试剂的识别单位， 单链抗体是由重链可变区和轻链可变区构成的小分子抗体，它仍然保持着天然抗体的特异 性和大致相似的亲和力。重链可变区和轻链可变区折叠成相对独立的结构域，由一条亲水 性的柔软的连接肽相连，从而形成和天然抗体中抗原结合位点相似的结构。由于其不含有 抗体的恒定区，异嗜性抗体无法和其结合，因此减少了人血中因异嗜性抗体的对检测抗体 非特异结合所带来的假阳性。同时，由于第三代抗体技术中噬菌体库的应用，也给我们提供 了简便、快速筛选得到高亲和力scFV的技术平台。同时，采用原核表达获得的scFV单链抗 体，其工艺简单，成本低廉，规模容易放大，可以从原材料上节约大量的资金，使试剂盒的成 本大幅度降低。
[0007] 虽然SCFV是一种优选的用于研究抗原抗体反应的物质形态，但其本身的状态很 难直接稳定地固定到疏水的聚苯乙烯基质表面，而且即使固定到了表面也几乎失去了抗原 结合的能力，因此scFV在诊断试剂上面的应用非常的少见。
【发明内容】
[0008] 针对上述现有的技术的优缺点，本发明的目的在于提供一种利用对聚苯乙烯固相 表现出特异性强吸附功能的连接肽，来连接scFV定向固定在聚苯乙烯疏水表面，从而制备 成胶乳增强免疫比浊试剂的方法。
[0009] 本发明的主要内容有：
[〇〇1〇] 1、本发明通过优化和改造的肽，实现了对疏水性的树脂表面表现出特异性吸附功 能。所述肽可以用于重链和轻链之间的连接肽，或与scFV的N端或C端的融合连接肽。 scFV通过上述肽定向链接到疏水的聚苯乙烯微球表面，不会因为scFV跟基质结合而导致 抗体结构改变或遮掩住抗原结合位点，从而影响抗体和抗原的反应，能最大限度的保证抗 体的亲和力。同时由于短肽对聚苯乙烯疏水表面有非常高的亲和力，因此优先的定向结合 到微球表面，不容易从微球脱落，提高了试剂稳定性。同时，由于scFV蛋白只有完整抗体的 1/6,因此空间位阻较小，单位面积的聚苯乙烯基质理论上能结合更多的单链抗体，使试剂 的灵敏度和线性范围更好。同时由于短肽只有7-12个氨基酸，大小很小，跟聚苯乙烯结合 后不能再结合其他的一些干扰蛋白或物质，因此可以进一步减少人血中的非特异性反应。
[0011] 2、抗体基因犾得：从喔囷体库中淘选得到的商未和力的scFV的基因序列或通过 从已有的高亲和力单克隆抗体细胞株中扩增得到的scFV的基因序列。
[0012] 3、通过基因重组的方法，构建scFV和上述结合肽以及6 XHis标签融合表达的载 体，并转化表达。其中肽可以用于重链和轻链之间的连接肽，或与scFV的N端或C端的融 合连接肽
[0013] 4、通过可溶表达到大肠杆菌细胞周质中，或在胞内包涵体表达复性后，经过镍柱 纯化，得到纯度高的单链抗体和结合肽融合形态的改造抗体。
[0014] 5、将改造抗体和聚苯乙烯微球在一定PH的缓冲液中进行包被、清洗、重悬制备成 免疫比浊试剂的R2试剂。
[0015] 6、再通过缓冲液、稳定剂、加速剂、表面活性剂、盐离子的组合调节制备R1试剂。
[0016] 7、R1和R2试剂配比，制备成胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。
[〇〇17] 本发明具有如下优势：本发明所提供的聚苯乙烯结合肽介导单链抗体在聚苯乙烯 微球表面的立体定向固定，实现了抗体向外展示及最大程度保持了固定后的抗体活性，同 时载体表面单位面积包被的有效抗体分子数增多，可以有效提高免疫比浊法的检测线性范 围和灵敏度。同时由于较小的肽端和结构简单的scFV，避免了血中的一些干扰因素和非特 异的反应，提高了胶乳增强免疫比浊试剂的准确性和抗干扰能力。同时，单链抗体的使用让 试剂的成本大大降低。本发明建立的一种单链抗体立体定向固定在聚苯乙烯表面的新方 法，有望在临床免疫诊断、免疫传感器、抗体芯片、噬菌体库筛选、蛋白纯化等领域发挥重要 作用。 【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为scFV和结合肽融合表达的载体构建图谱
[0019] 图2为传统抗体被动吸附到聚苯乙烯表面与scFV通过结合肽定向固定到聚苯乙 烯表面的对比示意图（A.完整抗体mAb ;B. scFV-PS2)
[0020] 图3为CRP(mAb)和（scFV-PS2)两种胶乳增强免疫比浊试剂灵敏性对比
[0021] 图4为CRP(mAb)和（SCFV-PS2)两种胶乳增强免疫比浊试剂线性范围对比（A.完 整抗体 mAb ;B. scFV-PS2) 【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0023] 1、单链抗体基因序列的获得
[0024] 可以从传统杂交瘤的方法筛选得来的高亲和力单克隆抗体的细胞株系中提取 RNA，并用特异的引物PCR扩增获得重链和轻链的可变区的编码序列。也可以用单链抗体噬 菌体库展示的方法，从构建好的针对某一特定抗原的噬菌体库中筛选得来。本具体实施案 例的CRP单链抗体的重链和轻链可变区编码序列是从单克隆抗体细胞株系中扩增得来，并 用一段亲水的柔性肽（Gly4Ser) 3将该单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接，构建到 PET22 中，形成 PET22-CRP(scFV)表达载体。
[0025] 2、CRP (scFV)和PS2融合原核表达载体构建
[0026] 将一对互补单链 DNA (5 ' -TCGAGCGAGCGTTCATTGCTACTCGACGAATTAAGCGACCA-3 '和 5' -TCGAGTGGTCGCTTAATTCGTCGAGTAGCAATGAACGCTCG-3'，下划线为 Xhol 酶切位点粘性末 端）。951：孵育15min后退火（60min内冷却至30°C)，产物（XhoI-PS2)插入CRP单链抗体原 核表达质粒PET22-CRP (scFV)的Xhol酶切位点，测序验证后命名为PET22-CRP (scFV) -PS2， 即为单链抗体和PS2融合原核表达载体。
[0027] 3、PET22-CRP (scFV) -PS2 融合表达载体转化
[0028] 将构建好的融合表达载体PET22-CRP (scFV) -PS2转化进E. coli Origami感受态 细胞中，涂板培养过夜；挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，8h后按1 : 100转接摇瓶；继 续振荡培养至0D600值在0. 4-0. 6时加入IPTG，37°C诱导表达4h后10000g离心收集菌体。
[0029] 4、CRP (scFV) -PS2融合蛋白的纯化
[0030] a)重溶上一步得到的细胞沉淀于30ml30mM Tris-HCl pH8. 0 20%的鹿糖中。加 入60 μ 10. 5M EDTA，pH8. 0 (终浓度为ImM)。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分钟。
[0031] b) 10000g4°C离心10分钟收集细胞，去除上清液。
[0032] c)在30ml冰冻的5mM MgS04溶液中彻底重溶沉淀，在冰上缓慢搅拌悬液10分钟。 此时周质蛋白被释放入缓冲液中。
[0033] d) 10000g4°C离心10分钟收集细胞。将上清液（周质组分）转移入离心管。避免 混入任何沉淀物。
[0034] e)将上清液透析至上样缓冲液中（50mM Tris-HCl pH8. 0、300mM NaCl、20mM咪 唑），6小时换液一次，换液三次后用Ni-NTA亲和纯化。
[0035] f)纯化好的CRP (scFV) -PS2单链抗体透析至PBS中。
[0036] 5、CRP (scFV) -PS2胶乳增强免疫比浊试剂R2的制备
[0037] a)取200 μ 1原胶乳，20000rpm离心15分钟，去除上清。取沉淀重悬溶于1ml的 胶乳洗涤缓冲液（50mM Gly，PH8.0)中。用胶乳洗涤缓冲液反复洗涤离心重悬三次，最后重 悬于lml胶乳洗涤缓冲液中。
[0038] b)吸取500μ 1洗涤后的胶乳，加入lmg抗体，加入包被缓冲液2ml(50mM Gly， PH8. 5)，在16°C混匀包被过夜。
[0039] c)20000rpm离心15分钟，去除包被缓冲液，加入封闭缓冲液13ml (50mM Gly，5g/L BSA，PH8. 5)，超声重悬胶乳，在30°C封闭30分钟。
[0040] d) 20000rpm离心15分钟，去除封闭缓冲液。用封闭缓冲液反复洗涤重悬三次。
[0041] e)6000rpm离心5分钟，取上清，重悬到12ml的胶乳储存缓冲液（50mM Gly，5g/ LBSA，6. 87g/LNaCl，1. 5g/LNaN3, ΡΗ8· 5)中，4°C保存。
[0042] 6、CRP (scFV) -PS2胶乳增强免疫比浊试剂R1配置
[0043] 磷酸二氢钠 2.86 g/L 磷酸氢二钠 28.65 g/L 氯化钠 6.87 g/L 氯化镁 0.34 g/L 叠氮钠 1.5 g/L 纯水 1 L
[0044] 7、CRP (scFV) -PS2胶乳增强免疫比浊试剂校准品的制备
[0045] a)校准品稀释液
[0046] 磷酸二氢钠 2.86g/L 磷酸氢二钠 28.65 g/L 氯化钠 9g/L 牛血清白蛋白 50 g/L 叠氮钠 1.5 g/L 稳定剂 10 g/L 纯水 1L
[0047] b)校准品配置
[0048] 按照需要的CRP参考校准品浓度将相应的重组CRP抗原纯品加入到校准品稀释 液中，制备成 〇· 05 μ g/ml、0. 1 μ g/ml、0. 5 μ g/ml、l μ g/ml、5 μ g/ml 10 μ g/ml 20 μ g/ml 40ug/ml 80 μ g/mll60 μ g/m 320ug/ml〇
[0049] 8、CRP (scFV) -PS2胶乳增强免疫比浊试剂的检测方法
[0050] 以日立7020操作为例：测定波长为600nm，分别取不同浓度的校准品溶液（3μ 1)， 加入降钙素原R1试剂（240 μ 1)，混匀，37°C孵育5分钟后，加入降钙素原R2试剂（60 μ 1)， 混匀，37°C孵育1分钟后，读取各管吸光度值Α1，反应4?5分钟后，读取各管吸光度值Α2， 计算吸光度差值ΛΑ = A2-A1。
[0051] 9、检测试剂盒的分析性能评估
[0052] a)敏感性和线性范围检测：根据以上的方法，每管重复测定3次，以各校准管3次 测得的吸光度差值ΛΑ的平均值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制"浓度-吸 光度差值"曲线。其中用CRP对应的mAb制备的试剂作为比较（图三）。同时根据曲线 选择合适的线性梯度，制备线性曲线，并计算线性回归的相关系数R 2。其中，可以明显发 现CRP(scFV)-PS2试剂反应更加的灵敏，线性范围更宽。CRP(scFV)-PS2试剂线性范围为 0· 1-160μ g/ml。CRP(mAb)试剂的线性范围为 1-80μ g/ml。
[0053] b)干扰试验：取CRP浓度为lug/ml的校准品，往里面加入不同浓度的类风湿因 子（RF，异嗜性抗体中的一种），RF的终浓度为：0几/1111、20几/1111、40几/1111、60几/1111，从而 检测异嗜性抗体对试剂的干扰（表一）。其中，CRP(scFV)-PS2试剂不受RF的影响，而 CRP (mAb)试剂随添加 RF的浓度增加，非特异反应增强。同时选取4例假阳性样本、4例 阳性样本、4例阴性样本来检测CRP(scFV)-PS2试剂的准确性和抗干扰能力（表二）。可 以发现，CRP(scFV)-PS2试剂在阴性和阳性样本上和CRP(mAb)试剂没有明显区别，但是 CRP(scFV)-PS2试剂由于不收干扰因素的影响，能够有效的识别假阳性的样本。
[0054] 表1类风湿因子对CRP (mAb)和（SCFV-PS2)两种胶乳增强免疫比浊试剂的干扰效 果检测
[0055]
【权利要求】
1. 一种利用聚苯乙烯结合肽定向连接单链抗体到聚苯乙烯微球表面，制备成胶乳增强 免疫比浊检测试剂盒的方法。
2. 根据权利要求1所述的肽，其特征在于，其为具有连接单链抗体（scFV)、多价单链抗 体（sc(FV)n)或恒定区融合型单链抗体（scFV-Fc)的重链和轻链功能的连接肽，所述肽在 抗体的重链和轻链之间、或在抗体的N端或C端，具有对固相表现出特异性吸附功能的氨基 酸序列。
3. 根据权利要求1所述的肽，其特征在于，所述氨基酸序列为：PS1 :HWGMWSY ;PS2 : RAFIATRR1KRP任意一个序列。
4. 根据权利要求1所述的肽，特征在于，所述氨基酸序列对疏水或亲水的树脂表面的 固相表现出特异性的吸附功能。
5. 根据权利要求1所述的结合肽制备胶乳增强免疫比浊试剂盒的方法，其特征在于 1) 该试剂盒包括R1试剂、R2试剂和校准品。 2) 用基因工程的方法将结合肽编码核苷酸序列插入带了目标抗体编码序列的原核表 达载体，构建结合肽融合抗体表达质粒，或者在体外用化学偶联的方法，把结合肽偶联到纯 化得到的抗体末端。 3) 表达并纯化标签肽融合抗体或纯化偶联抗体。 4) 将纯化好的抗体融合结合肽加到经过清洗的聚苯乙烯微球中，16°C混合包被过夜， 经过封闭、清洗、重悬等步骤制备成R2。
6. 根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可在半 自动、全自动生化分析仪以及散射比浊分析仪上使用。
【文档编号】G01N33/68GK104111334SQ201310571298
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】唐勇 申请人:唐勇