氨基寡糖素原药的检测方法
【专利摘要】本发明涉及检测【技术领域】，具体地涉及氨基寡糖素原药的定性定量检测方法，其特征在于包括氨基寡糖素质量分数的检测、聚合度的检测、pH值的检测、水不溶物的检测、灰分的检测、水分的检测。氨基寡糖素原药以虾蟹虾壳为原料，经去钙、去蛋白、脱色、脱乙酰、分检、粉碎制成的工业级氨基寡糖素，鉴别方法采用质谱法、红外光谱法和离子色谱法进行。氨基寡糖素原药聚合度测定采用样品的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法进行检测，氨基寡糖素含量的检测方法包括淋洗液制备、标样溶液配制、样品溶液配制和计算。该测定方法有效保证氨基寡糖素原药产品质量，维护生产、销售和消费者三方的权益。本发明的检测方法，准确度、灵敏度高，便于管理部门和用户对氨基寡糖素原药的质量进行监督和控制。
【专利说明】氨基寡糖素原药的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测【技术领域】，具体地涉及氨基寡糖素原药的检测方法。
【背景技术】
[0002]氨基寡糖素作为一类重要的植物诱导抗病剂，来源于植物的寡聚糖的研究，是当今糖生物学的一个重要领域，研究表明，氨基寡糖素在抵御病原菌侵蚀的过程中，能诱导激发植物产生一系列的防御反应:1、产生一些合成抗毒素的蛋白酶，并积累对病原菌起拮抗作用的低分子量的次生物代谢产物，如植保素；2、诱导一些具有抗性的水解酶类和病程相关蛋白，这些蛋白直接抑制病原物生长或释放一些寡聚糖素(具有活性的寡聚糖)；3、积累一些特殊的，作为结构组分的蛋白，结构蛋白结合在细胞表面并参与对病原物的限制作用。这些防御反应协同作用阻止病原菌的传播和入侵，达到防病治病的作用。同时，氨基寡糖素也是一类新的植物激素，具有调节和控制植物生长发育等作用，它能发出调节特定植物功能的信息，这些功能包括促生长、抗寒、抗旱等。
[0003]本检测方法可有效保证产品质量，维护生产、销售和消费者三方的权益，便于管理部门和用户对氨基寡糖素原药的质量进行监督和控制。
【发明内容】
[0004]为有效保证氨基寡糖素原药产品质量，维护生产、销售和消费者三方的权益，本发明提供了氨基寡糖素原药检测方法，准确度、灵敏度高，便于管理部门和用户对氨基寡糖素原药的质量进行监督和控制。氨基寡糖素原药的检测方法，其特征在于包括氨基寡糖素聚合度的检测、质量分数的检测、PH值的检测、水不溶物的检测、灰分的检测、水分的检测。
[0005]本发明的氨基寡糖素原药的检测方法，其特征在于氨基寡糖素原药以虾蟹壳为原料，经去钙、去蛋白、脱色、脱乙酰、分检、粉碎制成的工业级氨基寡糖素。
[0006]本发明的检测方法，其特征在于氨基寡糖素的鉴别采用质谱法、红外光谱法和离子色谱法进行。
[0007]本发明的检测方法，其特征在于聚合度的测定采用样品基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)法进行检测，通过质谱仪自带Bruker PolyTools数据处理软件，进行样品数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、多分散性(pd)和平均聚合度(DP)统计分析。
[0008]本发明的的检测方法，其特征在于，氨基寡糖素质量分数的检测方法包括试材:离子色谱仪、含醋酸钠溶液作淋洗液、D-盐酸氨基葡萄糖作标样。
[0009]本发明的检测方法，其特征在于离子色谱法中，色谱仪为ICS-3000离子色谱仪，包含在线脱气装置的四元梯度泵、柱温箱、ED3000电化学检测器、淋洗液自动发生器、Chrome I eon6.80色谱工作站。离子色谱法中的色谱条件为，分析柱为CarboPacTMPAlO,保护柱为CarboPacTMPAIOBioLCTM ;采用ED3000脉冲安培检测，Au工作电极，Ag/AgCl参比电极模式，糖标准四电位，淋洗液为IOOmM NaOH和NaAc/H20=10:90，流速为1.0mL/min。[0010]离子色谱法的测定步骤如下:
[0011]1、淋洗液制备方法:在2L塑料试剂瓶中加入约ImL经过0.4 μ m尼龙滤膜过滤的超纯水，加入无水NaAcl6.4g，再移入50%Na0H溶液10.5mL至水面以下，然后加入超纯水至2L,通氣气保护后摇勾备用；
[0012]2、标样溶液配制方法:准确称取D-盐酸氨基葡萄糖标样2.8mg，置于IOmL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，用超纯水对上述标样液进行准确稀释，配制系列浓度标样溶液，做为样品水解后氨基葡萄糖含量检测定量线绘制溶液；
[0013]3、样品溶液配制方法:取IOmL带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的厚壁耐压管I支，准确称取氨基寡糖原药样品约25mg加入其中,然后用移液管加入6.0mol/L盐酸3.0mL,充分混匀后在管子里充入高纯度氮气并将管子密封，然后100°C油浴下搅拌水解24h。冷却到室温后打开螺旋盖，将水解液转移到蒸发皿中，用6mL蒸馏水分3次洗涤水解管的内壁，合并到相应蒸发皿中，在70°C烘箱中挥发至干。加5.0mL双蒸水将蒸发皿中的固体溶解，并转移到50mL容量瓶中，用5mL双蒸水洗涤蒸发皿，液体并入到相应的容量瓶中，再重复此步骤2次，用双蒸水定容到50mL，稀释100倍，得到待测氨基寡糖素水解溶液。
[0014]样品溶液的计算方法，其特征在于，待仪器充分稳定后，连续进样数针D-盐酸氨基葡萄糖标样溶液，计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%，进行标样溶液的检测，绘制标准曲线做为氨基寡糖素含量检测定量线，当线性相关系数R2≥0.995，即进行样品溶液检测。
[0015]氨基寡糖素样品水解后溶液中氨基葡萄糖的浓度用方程I进行计算:
[0016]方程1:C氨基葡萄糖=(峰面积_b) /a
[0017]其中:C氨基葡萄糖:样品溶液中氨基葡萄糖的浓度；
[0018]峰面积:样品溶液中氨基葡萄糖平行检测峰面积的平均值；
[0019]a:氨基寡糖素含量检测定量线的斜率；
[0020]b:氨基寡糖素含量检测定量线的截距；
[0021]样品中氨基寡糖素的质量百分含量X (%)用方程2进行计算:
[0022]方程2:
[0023]
【权利要求】
1.氨基寡糖素原药的检测方法，其特征在于包括氨基寡糖素聚合度的检测、质量分数的检测、pH值的检测、水不溶物的检测、灰分的检测、水分的检测。
2.根据权利要求1的氨基寡糖素原药的检测方法，其特征在于氨基寡糖素原药以虾蟹壳为原料，经去钙、去蛋白、脱色、脱乙酰、分检、粉碎制成的工业级氨基寡糖素。
3.根据权利要求1的检测方法，其特征在于氨基寡糖素的鉴别采用质谱法、红外光谱法和离子色谱法进行。
4.根据权利要求1-3任一项的检测方法，其特征在于聚合度的测定采用样品基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)法进行检测，通过质谱仪自带BrukerPolyTools数据处理软件，进行样品数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、多分散性(pd)和平均聚合度(DP)统计分析。
5.根据权利要求4的检测方法，其特征在于，氨基寡糖素质量分数的检测方法包括试材:离子色谱仪、含醋酸钠溶液作淋洗液、D-盐酸氨基葡萄糖作标样。
6.根据权利要求5的检测方法，其特征在于离子色谱法中，色谱仪为ICS-3000离子色谱仪，包含在线脱气装置的四元梯度泵、柱温箱、ED3000电化学检测器、淋洗液自动发生器、Chrome I eon6.80色谱工作站。
7.根据权利要求6的检测方法，其特征在于离子色谱法中的色谱条件为，分析柱为CarboPacTMPAlO,保护柱为 CarboPacTMPAIOBioLCTM ;采用 ED3000 脉冲安培检测，Au 工作电极，Ag/AgCl参比电极模式，糖标准四电位，淋洗液为IOOmM NaOH和NaAc/H20=10:90，流速为 1.0mT,/miη。
8.根据权利要求7的检测方法，其特征在于步骤如下: 淋洗液制备方法:在2L塑料试剂瓶中加入约ImL经过0.4 μ m尼龙滤膜过滤的超纯水，加入无水NaAcl6.4g,再移入50%Na0H溶液10.5mL至水面以下,然后加入超纯水至2L,通氮气保护后摇匀备用； 标样溶液配制方法:准确称取D-盐酸氨基葡萄糖标样2.8mg,置于IOmL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，用超纯水对上述标样液进行准确稀释，配制系列浓度标样溶液，做为样品水解后氨基葡萄糖含量检测定量线绘制溶液； 样品溶液配制方法:取IOmL带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的厚壁耐压管I支，准确称取氨基寡糖原药样品约25mg加入其中,然后用移液管加入6.0mol/L盐酸3.0mL,充分混匀后在管子里充入高纯度氮气并将管子密封，然后100°C油浴下搅拌水解24h。冷却到室温后打开螺旋盖，将水解液转移到蒸发皿中，用6mL蒸馏水分3次洗涤水解管的内壁，合并到相应蒸发皿中，在70°C烘箱中挥发至干。加5.0mL双蒸水将蒸发皿中的固体溶解，并转移到50mL容量瓶中，用5mL双蒸水洗涤蒸发皿，液体并入到相应的容量瓶中，再重复此步骤2次，用双蒸水定容到50mL，稀释100倍，得到待测氨基寡糖素水解溶液。
9.根据权利要求7或8的检测方法，其特征在于，待仪器充分稳定后，连续进样数针D-盐酸氨基葡萄糖标样溶液，计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%，进行标样溶液的检测，绘制标准曲线做为氨基寡糖素含量检测定量线，当线性相关系数R2 > 0.995，即进行样品溶液检测。
10.根据权利要求9的检测方法，其特征在于，氨基寡糖素质量分数的计算方法如下: 样品溶液计算方法:制备D-盐酸氨基葡萄糖标样，计算回收率，作为原药含量检测的校正因子K ;在前述操作条件下，待仪器充分稳定后，连续进样数针D-盐酸氨基葡萄糖标样溶液，计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%，进行标样溶液的检测，绘制标准曲线做为氨基寡糖素含量检测定量线，当线性相关系数R2 ^ 0.995，即进行样品溶液检测； 氨基寡糖素样品水解后溶液中氨基葡萄糖的浓度用方程I进行计算: 方程1:c氨基葡萄糖=(峰面积_b) /a 其中:C氨基葡萄糖:样品溶液中氨基葡萄糖的浓度； 峰面积:样品溶液中氨基葡萄糖平行检测峰面积的平均值； a:氨基寡糖素含量检测定量线的斜率； b:氨基寡糖素含量检测定量线的截距； 样品中氨基寡糖素的质量百分含量X (%)用方程2进行计算: 方程2:
【文档编号】G01N27/64GK103913507SQ201310571452
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年11月16日 优先权日:2013年11月16日
【发明者】曹立冬, 张善学, 黄啟良, 吴军, 文香玲 申请人:海南正业中农高科股份有限公司, 中国农业科学院植物保护研究所