一种大曲中赭曲霉毒素a的提取、纯化方法
【专利摘要】本发明属于食品加工工艺领域，涉及固态食品发酵产物中毒素的检测方法，具体为一种大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法。该方法包括以下步骤：①取一定量粉碎后的大曲样品，置于离心管内，然后加入一定量的样品提取液，在涡旋振荡器上剧烈震荡；②采用离心机进行离心；③取上清液，通过玻璃纤维滤纸进行过滤；④准确量取一定量的过滤后液体于离心管内，加入三氯甲烷试剂，在涡旋振荡器上剧烈震荡后再静置；⑤待分层后，取下层三氯甲烷相于离心管内，在温度为50℃的条件下用氮气吹干；⑥取色谱级甲醇于氮气吹干后的离心管内，剧烈震荡，溶解赭曲霉毒素A。本提取纯化方法成本低，效果好，简单易行，提取率高。
【专利说明】—种大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品加工工艺领域，涉及固态食品发酵产物中毒素的检测方法，具体为一种大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法。
【背景技术】
[0002]赭曲霉毒素A是一种无色结晶化合物。可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液。微溶于水。赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)、花生、蔬菜(豆类)等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。在动物试验中还观察到它的致畸作用。
[0003]近年来，食品安全已引起社会广泛的关注。采用ELASA (酶联免疫法)可以很快的检测待测样品中赭曲霉毒素含量。然而如何快速、有效的提取和纯化毒素已成为制约该技术应用的瓶颈。应用本技术可以快速、准确提取大曲、酒醅、固态发酵法制备的食品样品等中的赭曲霉毒素，用于后续的ELASA或液相色谱检测。
[0004]酶联免疫法是指利用抗原和抗体的免疫反应和酶的高效催化作用，在一定条件下呈现色泽反应，通过分光光度计对其进行定性定量测定。该方法有特异性强、灵敏度高、分析速度快等优点，可以快速的针对待测样品中赭曲霉毒素A含量进行定性、定量检测。
[0005]ELASA方法对待测样品中赭曲霉毒素A含量进行定量检测时精确度不高是一个长期困扰该方法推广使用的主要问题，传统意义上的使用免疫亲和柱进行提取纯化，效果虽好，但对设备要求高，步骤复杂，且价格昂贵、花费较高，因此如何简便快捷、经济有效的提取和纯化毒素成为制约该技术应用的瓶颈。
[0006]通过比较赭曲霉毒素ELASA试剂盒内赭曲霉毒素提取效果和国标GBT25220-2010免疫亲和柱法的提取效果，发现现有的ELASA试剂盒内赭曲霉毒素A提取效果比免疫亲和柱纯化法得到的赭曲霉毒素含量要低；而采用赭曲霉毒素免疫亲和柱提取纯化赭曲霉毒素无疑会大大增加检测成本。因此通过对固态成品大曲样品中赭曲霉毒素A提取、纯化工艺的改进来解决这一问题非常必要。
【发明内容】
[0007]本发明正是针对以上技术问题，提供一种大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法，该方法的检测成本低，效果好，对设备要求低，步骤简单且快捷。
[0008]本发明的具体技术方案如下:
[0009]①取一定量粉碎后的大曲样品，置于离心管内，然后加入一定量的样品提取液，在涡旋振荡器上剧烈震荡；所述的样品提取液为去离子水与甲醇按体积比为7:3的比例进行混合的液体，甲醇为色谱纯；大曲样品的质量:样品提取液的体积=1:4，在涡旋振荡器上剧烈震荡的时间为lOmin。[0010]②采用离心机进行离心；所采用的离心机为4000rpm，离心时间为5min。
[0011]③取上清液，通过玻璃纤维滤纸进行过滤；
[0012]④准确量取一定量的过滤后液体于离心管内，加入三氯甲烷试剂，在涡旋振荡器上剧烈震荡后再静置；所述的三氯甲烷试剂为色谱纯，过滤后的液体与三氯甲烷的体积比为1:1。在涡旋振荡器上剧烈震荡后再静置，其剧烈震荡的时间为5min，静置IOmin
[0013]⑤待分层后，取下层三氯甲烷相于离心管内，在温度为50°C的条件下用氮气吹干;
[0014]⑥取色谱级甲醇于氮气吹干后的离心管内，剧烈震荡，溶解赭曲霉毒素A。最后0.5mL甲醇中赭曲霉毒素A的含量与0.5g大曲中的含量相等。
[0015]本发明的积极效果体现在:
[0016](一)、提取成本低，效果好，提取和纯化率高；
[0017](二)、对设备要求低，步骤简单且快捷；
[0018](三)、本提取和纯化的方法比较省时，国标法由于需要亲和柱纯化法，至少需要4-6的时间，而本方法仅需要半小时左右的时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为赫曲霉毒素A标准品梯度稀释后绘制的标准曲线。从图1可以看出，相关系数达到0.9994，且变异率小于10%，符合实验要求。
【具体实施方式】
[0020]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
[0021]实施例1:
[0022]一种大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法，具体包括以下步骤:
[0023]①取5g粉碎后的大曲样品，置于50ml的离心管内，然后加入20ml的样品提取液，在涡旋振荡器上剧烈震荡IOmin ;样品提取液为去离子水与甲醇按体积比为7:3的比例进行混合的液体，甲醇为色谱纯，大曲样品的质量:样品提取液的体积=1:4。
[0024]②采用4000rpm的离心机进行离心5min ；
[0025]③取IOml的上清液，通过玻璃纤维滤纸进行过滤；
[0026]④准确量取4ml过滤后液体于20ml的离心管内，加入4ml三氯甲烷试剂，在涡旋振荡器上剧烈震荡5min后再静置IOmin ；
[0027]⑤待分层后，取下层三氯甲烷相2ml于5ml的离心管内，在温度为50°C的条件下用氮气吹干；
[0028]⑥取0.5ml色谱级甲醇于氮气吹干后的离心管内，剧烈震荡，溶解赭曲霉毒素A，0.5mL甲醇中赭曲霉毒素A的含量与0.5g大曲中的含量相等。
[0029]标准曲线的绘制
[0030]标准品进行3倍稀释后得到工作浓度梯度分别为0ppb，0.lppb,0.3ppb,0.9ppb，
2.7ppb，8.1ppb (ppb 相当于 ii g/kg)，标号为 C1、C2、C3、C4、C5、C6。设置酶标仪于 450nm 处进行OD值的检测，检测数据通过RIDAWIN软件分析后得到的检测结果以及标准曲线如表1与图1所示:
[0031]表1.赭曲霉毒素A标准样品的检测结果
【权利要求】
1.一种大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法，其特征在于包括以下步骤: ①取一定量粉碎后的大曲样品，置于离心管内，然后加入一定量的样品提取液，在涡旋振荡器上剧烈震荡； ②采用离心机进行离心； ③取上清液，通过玻璃纤维滤纸进行过滤； ④准确量取一定量的过滤后液体于离心管内，加入三氯甲烷试剂，在涡旋振荡器上剧烈震荡后再静置； ⑤待分层后，取下层三氯甲烷相于离心管内，在温度为50°C的条件下用氮气吹干； ⑥取色谱级甲醇于氮气吹干后的离心管内，剧烈震荡，溶解赭曲霉毒素A。
2.根据权利要求1所述的所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法，其特征在于:步骤①中所述的样品提取液为去离子水域甲醇按体积比为7:3的比例进行混合的液体，甲醇为色谱纯。
3.根据权利要求1所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法，其特征在于:步骤④所述的三氯甲烷试剂为色谱纯，过滤后的液体与三氯甲烷的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法，其特征在于:步骤①中所述的大曲样品的质量 :样品提取液的体积=1:4，在涡旋振荡器上剧烈震荡的时间为IOmin0
5.根据权利要求1所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法，其特征在于:步骤②中所述的采用离心机进行离心，所采用的离心机为4000rpm，离心时间为5min。
6.根据权利要求1所述的大曲中赭曲霉毒素A的提取、纯化方法，其特征在于:步骤④中在涡旋振荡器上剧烈震荡后再静置，其剧烈震荡的时间为5min，静置lOmin。
【文档编号】G01N1/28GK103604674SQ201310601670
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】罗惠波, 叶光斌, 边名鸿, 卫春会, 杨晓东, 李丹宇 申请人:四川理工学院