一种散结镇痛药品的检测方法

文档序号:6186661阅读:341来源:国知局
一种散结镇痛药品的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种散结镇痛药品的检测方法,包括以下步骤:(1)将散结镇痛药品待测样品与醇类化合物混合,得到待测溶液;(2)将所述待测溶液进行液相色谱检测,得到所述待测溶液的指纹图谱;所述液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱;(3)根据所述待测溶液的指纹图谱、预定标准曲线和散结镇痛药品样品的质量,得到散结镇痛药品待测样品中所含成分的含量。本发明采用梯度洗脱进行液相色谱检测,得到的指纹图谱中各活性成分的色谱峰峰形和分离度均较好,有利于计算色谱峰的峰面积,从而得到散结镇痛药品样品中各成分的含量。本发明提供的方法实现了对散结镇痛药品中各活性成分的定量测定,从而能够更真实的反映散结镇痛药品的品质。
【专利说明】一种散结镇痛药品的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药分析【技术领域】,尤其涉及一种散结镇痛药品的检测方法。
【背景技术】
[0002]散结镇痛药品的处方中含有龙血竭、三七、浙贝母和薏苡仁,其功能为软坚散结、化瘀定痛,主要用于治疗痰瘀互结兼气滞所致的继发性痛经、月经不调、盆腔包块、不孕以及子宫内膜异位等疾病。散结镇痛药品中含有酚类化合物、皂苷类化合物、生物碱和油脂等化学成分,这些化学成分对散结镇痛药品发挥药效具有重要的作用,因此检测散结镇痛药品中相关成分的方法成为人们研究的焦点。
[0003]现有技术公开了一种散结镇痛药品中黄酮类成分的检测方法(颜月园,萧伟,吴云.散结镇痛胶囊中黄酮类成分的指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18:5.),具体过程为:采用液相色谱检测,检测条件为Waters SymmetryiC18色谱柱;流动相为乙腈-水;检测波长为275nm ;流动相流速为1.0mL ^mirT1 ;色谱柱柱温为30°C;对照品溶液的制备方法为取7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A和龙血素B适量,加适量的甲醇制成7,4’ - 二羟基黄酮质量浓度为0.0504mg/mL、龙血素A质量浓度为0.0522mg/mL、龙血素B质量浓度为0.0934mg/mL的混合溶液;供试品溶液的制备方法为取散结镇痛胶囊样品2g,加入50mL质量百分浓度为50% 的甲醇的水溶液,进行超声提取30min,将提取后的溶液滤过,取续滤液采用0.45μ m的滤膜滤过。检测结果为散结镇痛胶囊中的主要成分为7,4’- 二羟基黄酮、龙血素A和龙血素B。
[0004]现有技术公开的散结镇痛药品的检测方法只能对散结镇痛药品中的相关成分进行定性的检测,没有对其进行定量的检测,因此现有技术提供的检测方法不能完全地反映散结镇痛药品的质量。

【发明内容】

[0005]有鉴于此,本发明的目的在于提供一种散结镇痛药品的检测方法,本发明提供的检测方法既能对散结镇痛药品中的相关成分进行定性检测又能对其进行定量检测,该方法能够全面的反映散结镇痛药品的质量。
[0006]本发明提供了一种散结镇痛药品的检测方法,包括以下步骤:
[0007](I)、将散结镇痛药品待测样品与醇类化合物混合,得到待测溶液;
[0008](2)、将所述待测溶液进行液相色谱检测,得到所述待测溶液的指纹图谱,所述液相色谱检测中的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为乙腈,所述流动相B为水或三氟乙酸,所述流动相A和流动相B的体积百分数之和为100% ;
[0009]所述液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱,所述梯度洗脱为:
[0010]O~12min内,所述流动相A的体积百分数从12%~14%上升至17%~19%,所述流动相B的体积百分数从86%~88%下降至81%~83% ;
[0011 ] 12min~22min内,所述流动相A的体积百分数从17%~19%上升至27%~29%,所述流动相B的体积百分数从81%?83%下降至71%?73% ;
[0012]22min?35min内,所述流动相A的体积百分数从27%?29%上升至39%?41%,所述流动相B的体积百分数从71%?73%下降至59%?61% ;
[0013]35min?45min内,所述流动相A的体积百分数保持在39%?41%,所述流动相B的体积百分数保持在59%?61% ;
[0014]46min?55min内,所述流动相A的体积百分数从39%?41%上升至89%?91%,所述流动相B的体积百分数从59%?61%下降至9%?11% ;
[0015](3)、根据所述待测溶液的指纹图谱、预定标准曲线和散结镇痛药品待测样品的质量,得到散结镇痛药品待测样品中所含成分的含量,所述标准曲线为散结镇痛药品待测样品所含成分的对照品溶液的质量浓度与相应的峰面积之间的线性曲线。
[0016]优选的,所述醇类化合物为C原子数为I?5的醇类化合物。
[0017]优选的,所述醇类化合物为乙醇或甲醇。
[0018]优选的,所述醇类化合物为无水甲醇。
[0019]优选的,所述梯度洗脱具体为:
[0020]O?12min内,所述流动相A的体积百分数从13%上升至18%,所述流动相B的体积百分数从87%下降至82% ;
[0021]12min?22min内,所述流动相A的体积百分数从18%上升至28%,所述流动相B的体积百分数从82%下降至72% ;
[0022]22min?35min内,所述流动相A的体积百分数从28%上升至40%,所述流动相B的体积百分数从72%下降至60% ;
[0023]35min?45min内,所述流动相A的体积百分数保持在40%,所述流动相B的体积百分数保持在60% ;
[0024]46min?55min内,所述流动相A的体积百分数从40%上升至90%,所述流动相B的体积百分数从60%下降至10%。
[0025]优选的,所述流动相的流速为1.5mL.mirT1?2.0mL.mirT1。
[0026]优选的,所述液相色谱检测的检测器为紫外检测器;
[0027]检测波长为260nm?300nm。
[0028]优选的,所述液相色谱检测中的色谱柱柱温为30°C?45°C。
[0029]优选的,所述步骤(I)为:
[0030]将散结镇痛药品待测样品溶于醇类化合物中,超声提取,得到待测溶液。
[0031]优选的,所述超声提取的时间为15分钟?60分钟。
[0032]本发明提供了一种散结镇痛药品的检测方法,包括以下步骤:(I)、将散结镇痛药品待测样品与醇类化合物混合,得到待测溶液;(2)、将所述待测溶液进行液相色谱检测,得到所述待测溶液的指纹图谱,所述液相色谱检测中的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为乙腈,所述流动相B为水或三氟乙酸,所述流动相A和流动相B的体积百分数之和为100% ;所述液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱,所述梯度洗脱为:0?12min内,所述流动相A的体积百分数从12%?14%上升至17%?19%,所述流动相B的体积百分数从86%?88%下降至81%?83% ;12min?22min内,所述流动相A的体积百分数从17%?19%上升至27%?29%,所述流动相B的体积百分数从81%?83%下降至71%?73% ;22min?35min内,所述流动相A的体积百分数从27%?29%上升至39%?41%,所述流动相B的体积百分数从71%?73%下降至59%?61% ;35min?45min内,所述流动相A的体积百分数保持在39%?41%,所述流动相B的体积百分数保持在59%?61% ;46min?55min内,所述流动相A的体积百分数从39%?41%上升至89%?91%,所述流动相B的体积百分数从59%?61%下降至9%?11% ; (3)、根据所述待测溶液的指纹图谱、预定标准曲线和散结镇痛药品待测样品的质量,得到散结镇痛药品待测样品中所含成分的含量,所述标准曲线为散结镇痛药品待测样品所含成分的对照品溶液的质量浓度与相应的峰面积之间的线性曲线。本发明采用这种梯度洗脱进行液相色谱检测,分离出了散结镇痛药品中的活性成分,得到的指纹图谱中各活性成分的色谱峰的峰形较好,且各色谱峰之间具有较好的分离度,有利于计算色谱峰的峰面积,从而得到散结镇痛药品待测样品中各成分的含量。本发明提供的方法实现了对散结镇痛药品中各活性成分的定量测定,从而能够更真实的反映散结镇痛药品的品质。
[0033]实验结果表明,本发明提供的散结镇痛药品的检测方法具有良好的重复性、稳定性以及精密度,能够准确测定散结镇痛药品待测样品中相关成分的含量。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1为本发明实施例1得到的待测溶液的指纹图谱;
[0035]图2为本发明实施例2得到的待测溶液的指纹图谱;
[0036]图3为本发明实施例3得到的对照品溶液的指纹图谱;
[0037]图4为本发明实施例5得到的白藜芦醇的标准曲线;
[0038]图5为本发明实施例5得到的7,4’ - 二羟基黄酮的标准曲线;
[0039]图6为本发明实施例5得到的龙血素A的标准曲线;
[0040]图7为本发明实施例5得到的龙血素B的标准曲线;
[0041]图8为本发明实施例5得到的紫檀芪的标准曲线;
[0042]图9为本发明实施例8得到的待测溶液的指纹图谱;
[0043]图10为本发明实施例9得到的待测溶液的指纹图谱;
[0044]图11为本发明实施例11得到的待测溶液的指纹图谱;
[0045]图12为本发明实施例12得到的待测溶液的指纹图谱;
[0046]图13为本发明实施例13得到的待测溶液的指纹图谱;
[0047]图14为本发明实施例14得到的待测溶液的指纹图谱;
[0048]图15为本发明实施例31得到的待测溶液的指纹图谱;
[0049]图16为本发明实施例32得到的待测溶液的指纹图谱;
[0050]图17为本发明实施例33得到的待测溶液的指纹图谱;
[0051]图18为本发明实施例34得到的待测溶液的指纹图谱;
[0052]图19为本发明实施例35得到的待测溶液的指纹图谱;
[0053]图20为本发明实施例36得到的待测溶液的指纹图谱;
[0054]图21为本发明实施例37得到的龙血素A的紫外吸收曲线;
[0055]图22为本发明实施例37得到的龙血素B的紫外吸收曲线;
[0056]图23为本发明实施例37得到的白藜芦醇的紫外吸收曲线;[0057]图24为本发明实施例37得到的7,4’ - 二羟基黄酮的紫外吸收曲线;
[0058]图25为本发明实施例37得到的紫檀芪的紫外吸收曲线;
[0059]图26为本发明实施例38得到的待测溶液的指纹图谱;
[0060]图27为本发明实施例39得到的待测溶液的指纹图谱;
[0061]图28为本发明实施例40得到的待测溶液的指纹图谱;
[0062]图29为本发明实施例41得到的待测溶液的指纹图谱;
[0063]图30为本发明实施例42得到的待测溶液的指纹图谱;
[0064]图31为本发明实施例43得到的待测溶液的指纹图谱;
[0065]图32为本发明实施例44得到的待测溶液的指纹图谱;
[0066]图33为本发明实施例45得到的待测溶液的指纹图谱;
[0067]图34为本发明实施例46得到的待测溶液的指纹图谱;
[0068]图35为本发明实施例47得到的待测溶液的指纹图谱;
[0069]图36为本发明实施例48得到的待测溶液的指纹图谱;
[0070]图37为本发明实施例49得到的待测溶液的指纹图谱;
[0071]图38为本发明实施例50得到的待测溶液的指纹图谱;
[0072]图39为本发明实施例51得到的待测溶液的指纹图谱;
[0073]图40为本发明实施例52得到的待测溶液的指纹图谱;
[0074]图41为本发明实施例53得到的待测溶液的指纹图谱;
[0075]图42为本发明实施例54得到的待测溶液的指纹图谱;
[0076]图43为本发明实施例63得到的待测溶液的对照指纹图谱;
[0077]图44为本发明实施例65得到的待测溶液的指纹图谱;
[0078]图45为本发明实施例66得到的待测溶液的指纹图谱;
[0079]图46为本发明实施例67得到的待测溶液的指纹图谱。
【具体实施方式】
[0080]本发明提供了一种散结镇痛药品的检测方法,包括以下步骤:
[0081](I)、将散结镇痛药品待测样品与醇类化合物混合,得到待测溶液;
[0082](2)、将所述待测溶液进行液相色谱检测,得到所述待测溶液的指纹图谱,所述液相色谱检测中的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为乙腈,所述流动相B为水或三氟乙酸,所述流动相A和流动相B的体积百分数之和为100% ;所述液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱,所述梯度洗脱为:
[0083]O?12min内,所述流动相A的体积百分数从12%?14%上升至17%?19%,所述流动相B的体积百分数从86%?88%下降至81%?83% ;
[0084]12min?22min内,所述流动相A的体积百分数从17%?19%上升至27%?29%,所述流动相B的体积百分数从81%?83%下降至71%?73% ;
[0085]22min?35min内,所述流动相A的体积百分数从27%?29%上升至39%?41%,所述流动相B的体积百分数从71%?73%下降至59%?61% ;
[0086]35min?45min内,所述流动相A的体积百分数保持在39%?41%,所述流动相B的体积百分数保持在59%?61% ;[0087]46min?55min内,所述流动相A的体积百分数从39%?41%上升至89%?91%,所述流动相B的体积百分数从59%?61%下降至9%?11% ;
[0088](3)、根据所述待测溶液的指纹图谱、预定标准曲线和散结镇痛药品待测样品的质量,得到散结镇痛药品待测样品中所含成分的含量,所述标准曲线为散结镇痛药品待测样品所含成分的对照品溶液的质量浓度与相应的峰面积之间的线性曲线。
[0089]本发明提供的散结镇痛药品的检测方法采用液相色谱进行检测,分离出了散结镇痛药品中的活性成分,得到的指纹图谱中各活性成分的色谱峰的峰形较好,且各色谱峰之间具有较好的分离度,有利于计算色谱峰的峰面积,从而得到散结镇痛药品待测样品中各成分的含量。本发明提供的方法实现了对散结镇痛药品中各活性成分的定量测定,从而能够更真实的反映散结镇痛药品的品质。
[0090]本发明将散结镇痛药品待测样品与醇类化合物混合,得到待测溶液;优选将散结镇痛药品待测样品与醇类化合物混合后进行成分提取,固液分离后得到待测溶液。本发明对所述固液分离的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的固液分离的技术方案即可,在本发明中,所述固液分离的方法优选为过滤。本发明对所述过滤的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的过滤的技术方案即可;在本发明中,所述过滤的方法优选为先进行滤纸过滤,再将得到的滤液采用滤膜进行过滤;所述滤纸优选为定量滤纸;所述滤膜的孔径优选为0.20 μ m?0.24 μ m,更优选为0.21 μ m?0.23 μ m,最优选为0.22 μ m。
[0091]本发明对所述散结镇痛药品待测样品的形态没有特殊的限制,可以直接将散结镇痛药品待测样品与醇类化合物混合,也可以将散结镇痛药品制备成粉末状待测样品。在本发明中,所述醇类化合物优选为C原子数为I?5的醇类化合物,更优选为甲醇或乙醇,最优选为甲醇,最最优选为无水甲醇;所述醇类化合物的纯度优选为分析纯。本发明对所述散结镇痛药品待测样品和醇类化合物的来源没有特殊的限制,如可以由市场购买获得,具体的,本发明可以采用江苏康缘药业股份有限公司提供的散结镇痛胶囊作为待测样品;采用南京化学试剂公司提供的甲醇或乙醇。
[0092]在本发明中,所述散结镇痛药品待测样品与醇类化合物的质量比优选为1: (10?50),更优选为1: (20?45),最优选为1: (30?42),最最优选为1: (35?40)。本发明为了准确得到上述质量比例的待测溶液,优选按照下述方法制备待测溶液:
[0093]精密称定散结镇痛药品待测样品后,向其中精密加入醇类化合物,将得到的混合溶液称定重量后进行成分提取,将成分提取后的溶液冷却后再次称定重量,用上述醇类化合物补足成分提取减失的重量,将补足重量后的溶液混合均匀后采用滤纸进行过滤,再将得到的滤液采用滤膜再次过滤,得到待测溶液。在本发明中,所述精密称定散结镇痛药品待测样品的称量精度为0.0Olg,所述精密加入醇类化合物的精度为1% ;所述冷却的温度优选为5°C?40°C,更优选为10°C?35°C,最优选为10°C?30°C。
[0094]本发明对所述混合、称定重量、过滤、滤膜过滤、精密称定、精密加入以及冷却的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的混合、称定重量、过滤、滤膜过滤、精密称定、精密加入以及冷却的技术方案即可,具体的,本发明可以采用摇匀的方法将上述溶液混合均勻;采用Mettler AE240型号的电子分析天平或BP211D型号的电子分析天平对上述混合溶液进行称定重量以及精密称定散结镇痛药品待测样品;采用自然冷却的方法将上述成分提取后的溶液冷却。[0095]在本发明中,所述成分提取的方法优选为超声波提取或回流提取;所述超声波提取的超声功率优选为240W?260W,更优选为245W?255W,最优选为250W ;所述超声波提取的超声频率优选为30KHz?50KHz,更优选为35KHz?45KHz,最优选为40KHz。所述回流提取的温度优选为80°C?98°C,更优选为85°C?95°C,最优选为90°C ;所述回流提取的时间优选为40min?80min,更优选为50min?70min,最优选为60min。的时间优选为;本发明更优选采用超声波进行成分提取;本发明对所述超声波提取采用的仪器没有特殊的限制,如可以采用昆山市超声仪器有限公司提供的KQ-250DB型数控超声波清洗器。在本发明中,所述成分提取的时间优选为15min?60min,更优选为20min?40min,最优选为25min?35min。
[0096]得到待测溶液后,本发明将待测溶液进行液相色谱检测,得到所述待测溶液的指纹图谱。本发明优选精密吸取待测溶液,将其注入液相色谱仪,进行液相色谱检测,得到所述待测溶液的指纹图谱。在本发明中,所述精密吸取待测溶液的精度为1%;本发明对所述吸取的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的吸取的技术方案即可。在本发明中,所述待测溶液的用量优选为3 μ L?8 μ L,更优选为4 μ L?6 μ L,最优选为5 μ L。在本发明中,所述液相色谱检测中的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为乙腈,所述流动相B为水或三氟乙酸,所述流动相A和流动相B的体积百分数之和为100%。在本发明中,所述流动相B优选为水,更优选为超纯水;所述乙腈和三氟乙酸的纯度优选为色谱纯。本发明对所述乙腈、三氟乙酸和超纯水的来源没有特殊的限制,如可以由市场购买获得,具体的,本发明可以采用美国天地公司提供的乙腈和三氟乙酸。
[0097]在本发明中,所述液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱,所述梯度洗脱具体为:
[0098]O?12min内,所述流动相A的体积百分数从12%?14%上升至17%?19%,所述流动相B的体积百分数从86%?88%下降至81%?83% ;优选的,所述流动相A的体积百分数从13%上升至18%,所述流动相B的体积百分数从87%下降至82% ;
[0099]12min?22min内,所述流动相A的体积百分数从17%?19%上升至27%?29%,所述流动相B的体积百分数从81%?83%下降至71%?73% ;优选的,所述流动相A的体积百分数从18%上升至28%,所述流动相B的体积百分数从82%下降至72% ;
[0100]22min?35min内,所述流动相A的体积百分数从27%?29%上升至39%?41%,所述流动相B的体积百分数从71%?73%下降至59%?61% ;优选的,所述流动相A的体积百分数从28%上升至40%,所述流动相B的体积百分数从72%下降至60% ;
[0101]35min?45min内,所述流动相A的体积百分数保持在39%?41%,所述流动相B的体积百分数保持在59%?61% ;优选的,所述流动相A的体积百分数保持在40%,所述流动相B的体积百分数保持在60% ;
[0102]46min?55min内,所述流动相A的体积百分数从39%?41%上升至89%?91%,所述流动相B的体积百分数从59%?61%下降至9%?11% ;优选的,所述流动相A的体积百分数从40%上升至90%,所述流动相B的体积百分数从60%下降至10% ;
[0103]本发明对所述流动相的体积百分数变化的方式没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的梯度洗脱中流动相的体积百分数变化方式即可,如可以采用线性变化的方式,具体的,在本发明中,所述梯度洗脱中流动相A的体积百分数优选线性上升,流动相B的体积百分数优选线性下降。在本发明中,所述流动相的流速优选为1.5mL.min-1?2.0mT,.min \ 更优选为 1.6mL.min 1 ~1.8mL.min \ 最优选为 1.7mL.min、
[0104]在本发明中,所述液相色谱检测中的色谱柱优选为Waters Symmetry@C18型号的色谱柱、Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 型号的色谱柱或 Phenomenex Kinetex2.6uC18100A型号的色谱柱,更优选为Phenomenex Kinetex2.6u C18100A型号的色谱柱;在本发明中,所述色谱柱填充剂优选为十八烷基硅烷键合硅胶。
[0105]在本发明中,所述液相色谱检测的色谱柱柱温优选为30°C~45°C,更优选为35°〇~421:,最优选为40°C;所述液相色谱检测的检测器优选为紫外检测器,所述检测的波长优选为260nm~300nm,更优选为270nm~290nm,最优选为280nm。
[0106]本发明对所述液相色谱检测使用的仪器没有特殊的限制,可以采用Agilentl290型号的超高压液相色谱仪或Agilentl200SL型号的液相色谱仪,采用DAD紫外检测器。
[0107]得到所述待测溶液的指纹图谱,本发明优选根据所述待测溶液的指纹图谱与预定的对照品溶液的指纹图谱,对散结镇痛药品待测样品进行定性检测。在本发明中,所述预定的对照品溶液的指纹图谱优选按照以下步骤获得:
[0108]制备对照品溶液;
[0109]将对照品溶液进行液相色谱检测,得到对照品溶液的指纹图谱。
[0110]在本发明中,所述对照品优选包括白藜芦醇、7,4 ’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和紫檀芪。本发明优选将白藜芦醇、7,4’- 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪与醇类化合物混合,得到对照品溶液;更优选精密称定白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和紫檀芪后将其混合,再加入醇类化合物,得到对照品溶液。在本发明中,所述对照品溶液中白藜芦醇的质量浓度优选为20 μ g/mL~40 μ g/mL,更优选为25 μ g/mL~35 μ g/mL,最优选为30 μ g/mL ;所述对照品溶液中7,4’ - 二羟基黄酮的质量浓度优选为20 μ g/mL~40y g/mL,更优选为25 μ g/mL~35 μ g/mL,最优选为30 μ g/mL ;所述对照品溶液中龙血素A的质量浓度优选为20 μ g/mL~40 μ g/mL,更优选为25 μ g/mL~35 μ g/mL,最优选为30 μ g/mL ;所述对照品溶液中龙血素B的质量浓度优选为30 μ g/mL~50 μ g/mL,更优选为35 μ g/mL~45 μ g/mL,最优选为40 μ g/mL ;所述对照品溶液中紫檀苗的质量浓度优选为90 μ g/mL~110 μ g/mL,更优选为95 μ g/mL~105 μ g/mL,最优选为100 μ g/mL。本发明对所述精密称定和混合的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的精密称定和混合的技术方案,将白藜芦醇、7,4’- 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪与醇类化合物称量准确、混合均匀即可。
[0111]在本发明中,所述白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮和紫檀芪的纯度优选大于99wt%;所述醇类化合物与上述技术方案所述醇类化合物一致,在此不再赘述。本发明对所述白藜芦醇、7,4’- 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪和醇类化合物的来源没有特殊的限制,可以由市场购买获得,具体的,本发明可以采用陕西永健制药有限公司提供的白藜芦醇、杭州广林生物医药科技有限公司提供的紫檀芪、中国药品`生物制品检定所提供的用于含量测定的龙血素A和龙血素B ;中国食品药品检定研究院提供的7,4’- 二羟基黄酮;南京化学试剂公司提供的甲醇或乙醇。
[0112]得到对照品溶液后,本发明将得到的对照品溶液优选按照上述技术方案所述的对散结镇痛药品样品待测溶液进行液相色谱检测的方法进行液相色谱检测,得到对照品溶液的指纹图谱,在此不再赘述;[0113]得到对照品溶液的指纹图谱后,本发明将对照品溶液的指纹图谱与上述技术方案所述散结镇痛药品样品待测溶液的指纹图谱进行比对,对散结镇痛药品待测样品进行定性测定,指认出散结镇痛药品样品待测溶液的指纹图谱中的色谱峰。本发明提供的方法能够对散结镇痛药品样品中的相关成分进行定量的检测,所述定量检测的方法具体为:
[0114]根据预定的标准曲线、上述技术方案得到的待测溶液的指纹图谱与所述散结镇痛药品待测样品的质量,得到散结镇痛药品待测样品中成分的含量;在本发明中,所述标准曲线为散结镇痛药品待测样品所含成分的对照品溶液的质量浓度与相应的峰面积之间的线性曲线,优选按照以下方法获得:
[0115]将所述散结镇痛药品待测样品所含成分的对照品制备成系列浓度的对照品溶液;
[0116]将所述系列浓度的对照品溶液进行液相色谱检测,得到指纹图谱;
[0117]根据所述指纹图谱中各色谱峰的峰面积及对应的对照品溶液中对照品的质量浓度,得到标准曲线。
[0118]在本发明中,所述对照品优选包括白藜芦醇、7,4 ’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和紫檀芪;本发明优选将白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪与醇类化合物混合,得到对照品溶液的母液,将所述母液用上述醇类化合物逐倍稀释,得到系列浓度的对照品溶液;
[0119]本发明对所述混合和稀释的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的制备对照品溶液的技术方案即可;本发明对所述母液中白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和紫檀芪的浓度以及所述母液稀释的倍数没有特殊的限制,能够确定母液及其稀释后的溶液中白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和紫檀芪的质量浓度值即可;在本发明中,所述白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪与醇类化合物和上述技术方案所述白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪与醇类化合物一致,在此不再赘述。
[0120]制备得到系列浓度的对照品溶液后,本发明分别对各浓度的对照品溶液进行液相色谱检测,得到指纹图谱;在本发明中,所述液相色谱检测的方法与上述技术方案所述对散结镇痛药品样品待测溶液的液相色谱检测方法一致,在此不再赘述;
[0121]得到系列浓度对照品溶液的指纹图谱后,本发明计算得到所述指纹图谱中各色谱峰的峰面积。本发明在计算色谱峰面积的过程中优选以龙血素B为参照物,本发明的检测方法建立的指纹图谱是主要针对散结镇痛药品中龙血竭酚类化合物建立的指纹图谱,发明人研究发现,龙血素B在指纹图谱中的保留时间适中,分离较好,对照品易得,因此选择龙血素B作为参照物。本发明对所述计算色谱峰面积的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的计算色谱峰面积的技术方案即可,如本发明可以采用Agilent ChemStation软件计算上述对照品溶液指纹图谱中各色谱峰的峰面积。
[0122]得到所述对照品溶液指纹图谱中各色谱峰的峰面积后,本发明根据所述色谱峰的峰面积及其对应的对照品在对照品溶液中的质量浓度,得到散结镇痛药品待测样品所含成分的标准曲线。本发明优选将色谱峰的峰面积值作为纵坐标,对应的对照品在对照品溶液中的质量浓度值作为横坐标,进行线性拟合,得到标准曲线。
[0123]本发明优选以白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和紫檀芪为对照品,分别得到白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和紫檀芪的标准曲线。在本发明中,所述白藜芦醇标准曲线的回归方程为Y1=Ie.906\-51.701,其中Y1为指纹图谱中白藜芦醇的色谱峰面积,X1为待测溶液中白藜芦醇的质量浓度,相关系数R1为0.9999 ;所述7,4’ - 二羟基黄酮标准曲线的回归方程为Y2=15.722X2+0.4522,其中Y2为指纹图谱中
7,4’ - 二羟基黄酮的色谱峰面积,X2为待测溶液中7,4’ - 二羟基黄酮的质量浓度,相关系数民为I ;所述龙血素A标准曲线的回归方程为Y3=I0.217X3-1.162,其中Y3为指纹图谱中龙血素A的色谱峰面积,X3为待测溶液中龙血素A的质量浓度,相关系数R3为I ;所述龙血素B标准曲线的回归方程为Y4=8.1063X4-2.4522,其中Y4为指纹图谱中龙血素B的色谱峰面积,X4为待测溶液中龙血素B的质量浓度,相关系数R4为I ;所述紫檀芪标准曲线的回归方程为Y5=14.5754XS-153.6806,其中Y5为指纹图谱中紫檀芪的色谱峰面积,X5为待测溶液中紫檀芪的质量浓度,相关系数R5为0.9998。
[0124]得到标准曲线后,本发明根据上述技术方案得到的待测溶液的指纹图谱、所述标准曲线和散结镇痛药品待测样品的质量,得到所述散结镇痛药品待测样品中所含成分的含量。本发明优选按照上述技术方案所述计算色谱峰面积的方法,计算得到待测溶液指纹图谱中各色谱峰的峰面积,根据得到的各色谱峰的峰面积及相应的标准曲线,得到待测溶液中各组分的质量浓度;根据所述待测溶液的体积和待测溶液中各组分的质量浓度,得到所述待测溶液中各组分的质量;根据所述待测溶液中各组分的质量和散结镇痛药品待测样品的质量,得到散结镇痛药品待测样品中所含组分的含量。本发明优选测定得到散结镇痛药品待测样品中白藜芦醇、7,4’ - 二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和紫檀芪的含量。
[0125]本发明提供的散结镇痛药品的检测方法,采用液相色谱进行检测,分离出了散结镇痛药品中的活性成分,得到的指纹图谱中各活性成分的色谱峰的峰形较好,且各色谱峰之间具有较好的分离度,有利于计算色谱峰的峰面积,从而得到散结镇痛药品待测样品中各成分的含量。本发明提供的方法实现了对散结镇痛药品中各活性成分的定量测定,从而能够更真实的反映散结镇痛药品的品质。
[0126]本发明对提供的散结镇痛药品的检测方法进行了方法学的考察,主要包括:待测溶液和对照品溶液的稳定性考察、精密度考察以及检测方法的重复性考察;在进行考察过程中测试了对照品的加样回收率以及定量限与检测限。本发明对所述稳定性、精密度、重复性的考察方法以及加样回收率和定量限与检测限的检测方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的考察稳定性、精密度、重复性的技术方案以及检测加样回收率和定量限与检测限的方法即可。
[0127]本发明待测溶液的稳定性考察结果说明,本发明提供的方法制备的待测溶液在24小时内具有良好的稳定性;本发明对照品溶液的稳定性考察结果说明,本发明提供的方法制备的对照品溶液在24小时内具有良好的稳定性;本发明待测溶液的精密度考察结果说明,本发明提供的方法制备的待测溶液具有良好的精密度;本发明对照品溶液的精密度考察结果说明,本发明提供的方法制备的对照品溶液具有良好的精密度;本发明检测方法的重复性考察结果说明,本发明提供的散结镇痛药品的检测方法具有良好的重复性;本发明对照品的加样回收率检测结果说明,本发明提供的检测方法能准确测定散结镇痛药品中相关成分的含量;本发明对照品的定量限与检测限的检测结果为,白藜芦醇的定量限为4.85ng、检测限为1.21ng ;7, 4,- 二轻基黄酮的定量限为2.14ng、检测限为1.07ng ;龙血素A的定量限为7.19ng、检测限为0.90ng ;龙血素B的定量限为6.30ng、检测限为1.58ng ;紫檀芪的定量限为7.41ng、检测限为1.80ng,这说明,本发明提供的方法对散结镇痛药品待测样品所含组分的测定具有较高的灵敏度。
[0128]为了进一步了解本发明,下面结合实施例对本发明提供的散结镇痛药品的检测方法进行详细描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0129]以下各实施例中,液相色谱检测采用的仪器为:Agilentl290超高压液相色谱仪、DAD紫外检测器;
[0130]超声波提取采用的仪器为:KQ_250DB型数控超声波清洗器;
[0131]称定重量采用的仪器为:Mettler AE240电子分析天平和BP211D电子分析天平;
[0132]所用的散结镇痛药品为江苏康缘药业股份有限公司提供的散结镇痛胶囊;所用的龙血素A的产品批号为111660-200402、龙血素B的产品批号为111558-200303,龙血素A和龙血素B均为中国药品生物制品检定所提供的用于含量测定的龙血素A和龙血素B ;所用的紫檀芪的产品批号为20110723,购买于杭州广林生物医药科技有限公司;所用的白藜芦醇购买于陕西永健制药有限公司;所用的乙腈和三氟乙酸均为色谱纯,购买于美国天地公司;所用的甲醇和乙醇均为分析纯,购买于南京化学试剂公司;7,4’ - 二羟基黄酮购买于中国食品药品检定研究院。
[0133]实施例1
[0134]精确称量散结镇痛药品粉末样品lg,将其置于具塞锥形瓶中,向具塞锥形瓶中精密加入无水乙醇25mL,将得到的混合溶液采用250W、40KHz的超声波进行成分提取30分钟,将成分提取后的溶液冷却到10°C,将冷却后的溶液过滤,取续滤液过0.22 μ m的滤膜,得到待测溶液;
[0135]将上述制备得到的待测溶液进行液相色谱检测,检测的条件具体为:
[0136]以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂;
[0137]色谱柱型号为Phenomenex Kinetex2.6u C18100A,色谱柱柱长为100mm,内径为
4.6mm,粒径为 2.6 μ m ;
[0138]色谱柱柱温为40°C;
[0139]以乙腈为流动相A,以超纯水为流动相B,所述流动相A和流动相B的体积百分数之和为100%,进行梯度洗脱:
[0140]O?12min内,所述流动相A的体积百分数从13%线性上升至18%,所述流动相B的体积百分数从87%线性下降至82% ;
[0141]12min?22min内,所述流动相A的体积百分数从18%线性上升至28%,所述流动相B的体积百分数从82%线性下降至72% ;
[0142]22min?35min内,所述流动相A的体积百分数从28%线性上升至40%,所述流动相B的体积百分数从72%线性下降至60% ;
[0143]35min?45min内,所述流动相A的体积百分数保持在40%,所述流动相B的体积百分数保持在60% ;
[0144]46min?55min内,所述流动相A的体积百分数从40%线性上升至90%,所述流动相B的体积百分数从60%线性下降至10% ;
[0145]所述流动相A和流动相B的流速为1.7mL.mirT1 ;[0146]检测波长为280nm。
[0147]将本发明实施例1制备的待测溶液进行液相色谱检测得到的指纹图谱如图1所示,图1为本发明实施例1得到的待测溶液的指纹图谱,根据得到的指纹图谱计算实施例1得到的待测溶液中主要成分的含量,所述待测溶液中主要成分的含量以单位质量的主要成分的峰面积表示,计算方法为将指纹图谱中主要成分的峰面积乘以待测溶液的稀释倍数除以待测溶液的取样量,计算结果如表1所示,表1为本发明实施例1和实施例2得到的待测溶液中主要成分的含量。
[0148]实施例2
[0149]采用实施例1的技术方案检测得到待测溶液的指纹图谱,并根据得到的指纹图谱计算指纹图谱中色谱峰的;不同的是,本实施例采用回流提取的方法替换实施例1中的超声提取,回流提取的时间为60分钟;检测结果如图2和表1所示,图2为本发明实施例2得到的待测溶液的指纹图谱。
[0150]表1本发明实施例1和实施例2得到的待测溶液中主要成分的含量
【权利要求】
1.一种散结镇痛药品的检测方法,包括以下步骤: (1)、将散结镇痛药品待测样品与醇类化合物混合,得到待测溶液; (2)、将所述待测溶液进行液相色谱检测,得到所述待测溶液的指纹图谱,所述液相色谱检测中的流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为乙腈,所述流动相B为水或三氟乙酸,所述流动相A和流动相B的体积百分数之和为100% ; 所述液相色谱检测的洗脱程序为梯度洗脱,所述梯度洗脱为: O~12min内,所述流动相A的体积百分数从12%~14%上升至17%~19%,所述流动相B的体积百分数从86%~88%下降至81%~83% ; 12min~22min内,所述流动相A的体积百分数从17%~19%上升至27%~29%,所述流动相B的体积百分数从81%~83%下降至71%~73% ; 22min~35min内,所述流动相A的体积百分数从27%~29%上升至39%~41%,所述流动相B的体积百分数从71%~73%下降至59%~61% ; 35min~45min内,所述流动相A的体积百分数保持在39%~41%,所述流动相B的体积百分数保持在59%~61% ; 46min~55min内,所述流动相A的体积百分数从39%~41%上升至89%~91%,所述流动相B的体积百分数从59%~61%下降至9%~11% ; (3)、根据所述待测 溶液的指纹图谱、预定标准曲线和散结镇痛药品待测样品的质量,得到散结镇痛药品待测样品中所含成分的含量,所述标准曲线为散结镇痛药品待测样品所含成分的对照品溶液的质量浓度与相应的峰面积之间的线性曲线。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述醇类化合物为C原子数为I~5的醇类化合物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述醇类化合物为乙醇或甲醇。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述醇类化合物为无水甲醇。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述梯度洗脱具体为: O~12min内,所述流动相A的体积百分数从13%上升至18%,所述流动相B的体积百分数从87%下降至82% ; 12min~22min内,所述流动相A的体积百分数从18%上升至28%,所述流动相B的体积百分数从82%下降至72% ; 22min~35min内,所述流动相A的体积百分数从28%上升至40%,所述流动相B的体积百分数从72%下降至60% ; 35min~45min内,所述流动相A的体积百分数保持在40%,所述流动相B的体积百分数保持在60% ; 46min~55min内,所述流动相A的体积百分数从40%上升至90%,所述流动相B的体积百分数从60%下降至10%。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述流动相的流速为1.5mL.min-1~2.0mT,.mirf1。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述液相色谱检测的检测器为紫外检测器; 检测波长为260nm~300nm。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述液相色谱检测中的色谱柱柱温为30°C~45°C。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)为: 将散结镇痛药品待测样品溶于醇类化合物中,超声提取,得到待测溶液。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述超声提取的时间为15分钟~60分 钟。
【文档编号】G01N30/06GK103760276SQ201310648506
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】萧伟, 王振中, 秦建平, 李家春, 陈宝来, 文红梅, 吴建雄 申请人:江苏康缘药业股份有限公司
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