红细胞处理洗脱放散试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种红细胞处理洗脱放散试剂盒，提供一种用于解离致敏在红细胞膜上的IgG抗体的方法及其应用。本红细胞处理洗脱放散试剂盒处理IgG抗体致敏的红细胞所得到的含抗体的放散液以及直接抗人球蛋白试验（DAT）阴性的红细胞，不仅可以用于经典的间接抗人球蛋白试验，还可以用于微柱凝胶卡检测红细胞抗原或检测放散液中的抗体。所述试剂盒中包含以下3种试剂：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ，其中溶液Ⅰ与溶液Ⅱ按照体积比1:1~1:8的比例混合，配制成洗脱液；溶液Ⅲ用于判定反应终点。本发明提供一种使用方便且质量稳定的放散试剂盒及其制备方法。
【专利说明】红细胞处理洗脱放散试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于解离致敏在红细胞上的IgG抗体的方法及其应用。更具体的说，本发明涉及一种红细胞处理洗脱放散试剂盒的组成、制备方法及其应用，涉及输血医学领域。
【背景技术】
[0002]红细胞上的抗原与血清中抗体在适合条件下发生凝集或致敏，这种结合是可逆的。如果改变某些物理条件(如温度)或化学条件(如pH时)，抗体又会从抗原抗体复合物上分离下来，这种方法称放散试验。放散试验是把结合到红细胞膜上的抗体解离下来，用于ABO亚型的鉴定、新生儿溶血病的诊断和自身免疫性溶血性贫血患者红细胞的抗体特异性的鉴定，以及吸收后把抗体再放散下来进行鉴定或制备单特异性抗体，是免疫血清学实验中非常重要的技术手段。放散试验的方法多种多样，但各有优缺点。很多试剂须临用新配，步骤繁琐，部分方法操作不易成功。本发明红细胞处理洗脱放散试剂盒处理IgG抗体致敏红细胞所得到的含抗体的放散液以及直接抗人球蛋白试验(DAT)阴性的红细胞，不仅可以用于经典的间接抗人球蛋白试验，还可以用于微柱凝胶卡检测红细胞抗原或检测放散液中的抗体。本发明红细胞处理洗脱放散试剂盒响应了市场的需求。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种使用方便且质量稳定的红细胞处理洗脱放散试剂盒及其制备方法，可以用于解离红细胞膜上致敏的IgG抗体。抗体解离后，仍能保持红细胞的结构，这样放散后的红细胞仍能检定其血型。
[0004]本发明的目的是这样实现的:一种红细胞处理洗脱放散试剂盒，它由溶液1、溶液II和溶液III组成。
[0005]所述的溶液I的主要成分是乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)，溶液II的主要成分是甘氨酸(Gly)，溶液III的主要成分是三羟甲基氨基甲烷(Tris)和溴甲酚紫。
[0006]所述溶液II的pH值至1.2^1.8 试剂盒的制备方法，包括以下步骤:
(1)溶液I的配制:称取一定量的乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)溶于蒸馏水或去离子水，定容至1000ml ;溶液I中乙二胺四乙酸二钠的质量浓度为8-12% ;优选10% ；
(2)溶液II的配制:称取一定量的甘氨酸(Gly)溶于生理盐水，定容至100ml，用12mol/L盐酸(HCl)调pH值至1.2^1.8。溶液II的中甘氨酸的质量浓度为0.6-0.9% ;优选
0.75%。
[0007]洗脱液的配制:使用前将溶液I与溶液II按照体积比1:1~1:8的比例混合，配制成洗脱液。
[0008](3)溶液III的配制:①称取一定量的三羟甲基氨基甲烷(TriS)和氯化钠(NaCl)，溶于蒸馏水或去离子水，定容至1000ml 称取一定量的溴甲酚紫溶于50ml，0.02mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液中，再加水稀释至250ml。将步骤①Tris-NaCl溶液与步骤②溴甲酚紫溶液混匀。溶液III用于判定反应终点。
[0009]将上述试剂溶液1、I1、III组装成盒，2?25° C保存。
[0010]本发明的原理是，在酸性环境下，由于pH值很小，红细胞上的抗原以及所结合的抗体产生质子化，带有同型的正电荷，使得通过正负电荷彼此结合的抗原抗体失去结合能力，由于带有同型电荷相互排斥而解离。抗原、抗体蛋白的三维结构由此受到影响，H+与天冬氨酸以及谷氨酸上的0H_基团结合引起三维立体分子结构的打开线性化，导致抗原抗体空间结构互补性的降低，抗原抗体解离。
[0011]本专利发明的红细胞处理洗脱放散试剂盒，具有以下优点:(I)反应快速，可在40分钟内判断检测结果；操作简便，无污染；(2)此方法可以解离红细胞膜上致敏的IgG抗体。抗体解离后，仍能保持红细胞的结构，这样对放散后的红细胞仍能检定其血型；(3)获得的红细胞可以用于抗原检测，也可以用于自身吸收；获得的放散液可以用于抗体检测；(4)所需孵育时间少，去除抗体效率高；(5)采用溴甲酚紫作为指示剂，溶液颜色由紫色转变为蓝色，准确确定反应终点。
[0012]【具体实施方式】:
本发明的红细胞处理洗脱放散试剂盒的制备方法包括以下步骤:
(1)溶液I的配制:称取IOOg乙二胺四乙酸二钠溶于蒸馏水或去离子水，定容至IOOOml ；
(2)溶液II的配制:称取0.75g甘氨酸溶于生理盐水，定容至100ml，用盐酸调pH值至
1.2?1.8 ；
(3)溶液III的配制:①称取2.1g的三羟基氨基甲烷和5.25g氯化钠，溶于蒸馏水或去离子水，定容至IOOOml ;②称取0.25g的溴甲酚紫溶于50ml，0.02mol/L氢氧化钠溶液中，再加水稀释至250ml ;将步骤①三羟甲基氨基甲烷-氯化钠溶液与步骤②溴甲酚紫溶液按4:1混匀。溶液III用于判定反应终点。
[0013]将上述试剂溶液1、II和III组装成盒。
[0014]本发明试剂盒的使用方法
实施例1:制备直接抗人球蛋白试验(DAT)阴性红细胞
(I)洗脱液的配制:溶液I与溶液II按照1:广1:8体积比混合，配制成洗脱液。
[0015](2)将DAT阳性的红细胞，以1:4 (体积比)生理盐水洗涤6次，得到压积红细胞。
[0016](3)取试管I支，加入洗脱液2ml，再加入Iml洗涤后的DAT阳性的压积红细胞，混匀。
[0017](4)室温孵育2min (不宜超过2min)，立即加入0.1ml溶液III，混匀，3000rpm XImin离心，分离得压积红细胞及上清液。
[0018](5)以1:4体积比生理盐水洗涤压积红细胞3次，用生理盐水配制成2?4%浓度红细胞悬液。
[0019](6)另取试管I支加入I滴上述2?4%浓度的红细胞和2滴抗人球蛋白试剂(抗IgG),混合后离心，轻微振荡试管，肉眼检查无凝集。
[0020]实施例2:制备放散液
(I)洗脱液的配制:溶液I与溶液II按照体积比1:广1:8的比例混合，配制成洗脱液。[0021 ] (2) DAT阳性的红细胞，以1:4 (体积比)生理盐水洗涤6次，得到压积红细胞。
[0022](3)取试管I支，加入洗脱液I飞ml，再加入Iml洗涤后的DAT阳性的压积红细胞，混匀。
[0023](4)室温孵育2min (不宜超过2min)，立即加入0.1ml溶液III，混匀，3000rpm XImin离心，分离得压积红细胞及上清液。
[0024](5)将上清液移至另一干净的试管中，滴加溶液III，以溶液颜色由紫色转变为蓝色为反应终点。
[0025](6) 3000rpm X 3min离心，上清液即为可用于抗体检测的放散液。
【权利要求】
1.一种红细胞处理洗脱放散试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由溶液1、溶液II和溶液III组成； 所述的溶液I的主要成分是乙二胺四乙酸二钠； 所述的溶液II的主要成分是甘氨酸； 所述的溶液III的主要成分是三羟甲基氨基甲烷和溴甲酚紫。
2.根据权利要求1所述的一种红细胞处理洗脱放散试剂盒，其特征在于，所述的溶液II的PH值是1.2~1.8。
3.制备如权利要求1所述的红细胞处理洗脱放散试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)溶液I的配制:称取乙二胺四乙酸二钠溶于蒸馏水或去离子水，配置乙二胺四乙酸二钠的质量浓度为8-12% ； (2)溶液II的配制:称取甘氨酸溶于生理盐水，并用盐酸调pH值至1.2^1.8 ;溶液II的中甘氨酸的质量浓度为0.6-0.9% ； (3)溶液III的配制:①称取一定量的三羟甲基氨基甲烷Tris和氯化钠NaCl，溶于蒸馏水或去离子水，定容至1000ml 称取一定量的溴甲酚紫溶于50ml，0.02mol/L氢氧化钠溶液中，再加水稀释至250ml，将步骤①Tris-NaCl溶液与步骤②溴甲酚紫溶液混匀； 将上述试剂溶液1、II和III组装成盒。
4.根据权利要求3所述的红细胞处理洗脱放散试剂盒的制备方法，其特征在于，所述溶液III的配制:①称取2.1g的三羟基氨基甲烷和5.25g氯化钠，溶于蒸馏水或去离子水，定容至1000ml ;②称取0.25g的溴甲酚紫溶于50ml，0.02mol/L氢氧化钠溶液中，再加水稀释至250ml ;将步骤①三羟甲基氨基甲烷-氯化钠溶液与步骤②溴甲酚紫溶液按4:1混匀。
5.根据权利要求3所述的红细胞处理洗脱放散试剂盒的制备方法，其特征在于，所述溶液I中乙二胺四乙酸二钠的质量浓度为10%。
6.根据权利要求3所述的红细胞处理洗脱放散试剂盒的制备方法，其特征在于，溶液II的中甘氨酸的质量浓度为0.75%。
7.—种红细胞处理洗脱放散试剂盒的使用方法，其特征在于，将权利要求1-6之一所述的红细胞处理洗脱放散试剂盒中的溶液I和溶液II制备成洗脱液，所述洗脱液中溶液I与溶液II按照体积比1: 1~1: 8，溶液III用于判定反应终点。
【文档编号】G01N1/28GK103674645SQ201310673750
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】陈玉平 申请人:江阴力博医药生物技术有限公司