一种检测人热休克蛋白(Hsp90α)的生物芯片及其检测方法
【专利摘要】一种检测人热休克蛋白(Hsp90α)的生物芯片及其检测方法，它涉及一种人热休克蛋白(Hsp90α)的生物芯片和检测方法。它的检测装置是由玻片、橡胶分隔片和金属固定夹组成，橡胶分隔片设置在玻片上方，两侧分别插入金属固定夹的凹槽中，将芯片和橡胶分隔片固定在一起。它的检测方法为：1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化；2、抗体蛋白与生物素交联，增加抗原的结合强度和灵活度；3、制备抗体芯片；4、利用抗体芯片检测微量血液标本中人热休克蛋白(Hsp90α)；5、数据分析。该方法操作简便，同时检测多个样本，可自动进行标准化校正，并生成信号强度的图表。
【专利说明】一种检测人热休克蛋白(Hsp90a)的生物芯片及其检测方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种检测抗原的生物芯片和检测方法，具体涉及一种人热休克蛋白(Hsp90 a )的生物芯片及其检测方法。
【背景技术】:
[0002]生物芯片一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等)的微阵列杂交型芯片(micro-arrays),阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的序列点阵。
[0003]根据与生物分子的系统化程度,生物芯片可以分为DNA芯片、RNA(核糖核酸)芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和神经元芯片。此外，根据生物分子的检测方式，生物芯片可大致分为两种类型，第一种为微阵列类型，其利用捕获探针(capturing probe)探索包含于样品中的特定的生化物质。具体地，将能够用作捕获探针(capturing probe)的物质固定在芯片的表面，然后，与需要分析的生化物质进行反应后，通过检测及分析有无反应，可以获得生化物质的信息。第二种为利用微流体的生物芯片，在芯片上设置微通道、微室和混合阀，以控制微流体，将生化物质固定在检测单元后，利用微流体使需要检测的生化物质与固定在检测单元的生化物质进行反应，以检测有无反应。从长远来看，且根据最近的小型化趋势，这是研究最活跃的领域。
[0004]制造和利用生物芯片需要能够与反应物质反应的探针的固定技术、能够检测有无反应的检测技术、及能够处理检测到的信息的信息处理技术。
[0005]其中，能够检测有无反应的检测技术一般使用诸如荧光、比色和同位素等特定方式的标记。这种标记技术对提高检测灵敏度非常重要。但是，存在的问题是，标记可能会使生物分子变形，或低分子物质无法被标记。还存在的问题是，标记过程消耗大量的样品，并且需要进行2-3个更多的步骤，对于蛋白质而言，各种蛋白质之间的标记差异增加了量化误差。目前，具有代表性的标记方式是激光诱导荧光检测方法。激光诱导荧光检测方法是目前最流行的光学方法，其中，利用荧光物质标记样品，利用标记的荧光物质检测与固定在基板上的探针间有无反应。然而，这种方法还存在的问题是，为了检测有无反应，需要光学测量系统，这造成需要很多时间和成本，而且，这种检测方法还在基于生物芯片的分析系统。
[0006]人热休克蛋白90a，即Hsp90a，是热休克蛋白家族中的重要成员。1989年国外专家首次报道了 Hsp90a的基因序列，确认了该蛋白的身份。1992年外国科学家发现，Hsp90 a能被肿瘤细胞分泌到细胞外，但其分泌调控机制在此后很长时间里并不清楚。
[0007]Hsp90 a这一全新肿瘤标志物的目前已得到确认，同时揭开了细胞外Hsp90 a与细胞内Hsp90a的分子差异，进一步说明了分泌型Hsp90 a能促进肿瘤侵袭及转移，且其在血液中的含量与肿瘤恶性程度正相关。这些发现证明了血液中Hsp90a作为肿瘤标志物的良好潜质。Hsp90 a肿瘤标志物具有广谱的特性，可用于肝癌、乳腺癌、结直肠癌等多个瘤种的临床检测，可实时准确地反映治疗效果。Hsp90 a作为肿瘤标志物，检查更方便快捷，成本也大大降低。只需取一滴血，即可通过这种试剂盒检测血浆中Hsp90 a的含量。有些肿瘤患者尽管并未表现出相关症状，但其Hsp90 a含量可能已经升高，如果先检测Hsp90a在血液中水平，再进行深入检查，就可能被确诊为肿瘤，这能使患者早日接受治疗，从而大大提高治愈率或延长生存期。
[0008]此外，患者血浆中Hsp90 a含量的高低与病情变化有较好的对应性，因此可实时、较准确地反映治疗效果，为医生制定和及时调整治疗方案提供参考。
【发明内容】
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[0009]本发明的目的是提供一种检测人热休克蛋白(Hsp90a)的生物芯片及其检测方法，每个膜块可同时检测80个血液样品，利用橡胶分隔片和玻片固定夹，可在一张芯片上有16个膜块，操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正，并生成各自身抗体信号强度的图表。
[0010]本发明采用以下技术方案:它的检测装置是由玻片、橡胶分隔片和金属固定夹组成，橡胶分隔片设置在玻片上方，两侧分别插入金属固定夹的凹槽中，将芯片和橡胶分隔片
固定在一起。
[0011]检测方法:1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化:将玻片浸泡在一定浓度的亲合素溶液中，室温放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，离心干燥，放4°C冰箱备用:2、抗体蛋白与生物素交联:增加抗体的结合强度和灵活度；3、制备抗体芯片:将抗体稀释为lmg/mL，用喷射式微阵列点样仪将抗体点在玻片表面的NC膜上，每张玻片上分为16个膜块，每个膜块都含有80个抗体和8个对照蛋白，点样时湿度保持在75%，点样完毕后室温放置2h，然后真空包装:4、利用抗体芯片检测微量血液标本中人热休克蛋白(Hsp90a) ;5、数据分析:用对应的分析软件进行分析。
[0012]所述的橡胶分隔片厚度约1_，大小和玻片一致，分隔片上有16个孔，孔的位置和孔径与抗体点样区相当，将橡胶分隔片覆盖在芯片表面，抗体点样区位于各个孔的正中位置。
[0013]本发明所选的人热休克蛋白(Hsp90a)的单抗为本实验室自己提供，通过蛋白质交联技术，将抗体和生物素(Biotin)联接，然后利用微阵列技术，用微阵列点样仪将生物素化的抗体固定于包被了亲和素(Streptavidin)的玻片载体上。每张玻片(25mmX73mm)被划分为16个膜块，每个膜块都含有80个抗体和8个对照蛋白。因此，每张芯片均含有16个包含了 80个抗体和8种对照蛋白的微阵列，每个膜块可同时检测80个样本。检测装置为一个有16个孔的橡胶分隔垫片和两个固定夹，橡胶分隔垫片与玻片大小一致，其孔的位置和大小与玻片上16个蛋白点样区的位置符合。检测时，首先将橡胶分隔片放置于玻片表面，用固定夹将玻片和橡胶分隔片固定在一起，将IuL样本与50uL样本稀释剂混合后，力口入橡胶分隔片的孔中进行反应，60min后弃反应液，加入IOOuL洗涤液，振荡洗涤3次，每次5min。然后加入荧光素Cy3标记的亲合素和荧光素Cy5标记的羊抗人IgG抗体(I: 1000稀释)，室温反应60min，吸去反应液，加入洗涤液洗3次，除去固定夹和分隔垫片，将玻片浸A PBS缓冲液中漂洗30s，低速离心(500rpm) 3min使玻片干燥。用激光扫描仪扫描玻片，扫描波长为535nm(Cy3)和632nm(Cy5)。图像用Gen印ix6.0软件分析，得出各点Cy3和Cy5的荧光强度，并以Cy3为内参算出各点的校正信号强度，然后用分析软件，计算出各个抗原的平均强度。
[0014]本发明可操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正，并生成对应样品信号强度的图表。
【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1为本发明中玻片的结构示意图；
[0016]图2为本发明中处理后玻片的结构示意图；
[0017]图3为本发明中橡胶分隔片的结构示意图；
[0018]图4为本发明中金属固定夹的结构示意图；
[0019]图5为本发明检测装置的装配结构示意图。
【具体实施方式】:
[0020]参照图1-5，本【具体实施方式】采用以下技术方案:它的检测装置是由玻片1、橡胶分隔片2和金属固定夹3组成，橡胶分隔片2设置在玻片I上方，两侧分别插入金属固定夹3的凹槽中，将玻片I和橡胶分隔片2固定在一起。
[0021]它的检测方法为:
[0022]1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化:将玻片浸泡在一定浓度的亲合素(Streptavidin)溶液中，室温放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，离心干燥，放4°C冰箱备用。
[0023]2、抗体蛋白与生物素交联:增加抗体的结合强度和灵活度。
[0024]3、抗体芯片的制备:将抗体稀释为lmg/mL，并转入384孔板中。用喷射式微阵列点样仪将抗原打印在玻片表面的NC膜上。每张玻片上点制16个膜块，每个膜块都含有80个抗原和8个对照蛋白，每个蛋白在每个膜块上重复两次。点样时湿度保持在75%。完成后室温放置2h，然后真空包装，4°C可保存两年。
[0025]4、利用抗体芯片检测微量血液标本中人热休克蛋白(Hsp90a):检测时，首先将橡胶分隔片放置于玻片表面，用固定夹将玻片和橡胶分隔片固定在一起，将IuL样本与50uL样本稀释剂混合后，加入橡胶分隔片的孔中进行反应，60min后弃反应液，加入IOOuL洗涤液，振荡洗涤3次，每次5min。然后加入荧光素Cy3标记的亲合素和荧光素Cy5标记的羊抗人IgG抗体(I: 1000稀释)，室温反应60min，吸去反应液，加入洗涤液洗3次，除去固定夹和分隔垫片，将玻片浸入PBS缓冲液中漂洗30s，低速离心(500rpm)3min使玻片干燥。用激光扫描仪扫描玻片，扫描波长为535nm(Cy3)和632nm(Cy5)。图像用Gen印ix6.0软件分析，得出各点Cy3和Cy5的荧光强度，并以Cy3为内参算出各点的校正信号强度。
[0026]5、数据分析:用对应的分析软件进行分析。
[0027]本发明所选的人热休克蛋白(Hsp90a)的单抗为本实验室自己提供，通过蛋白质交联技术，将抗体和生物素(Biotin)联接，然后利用微阵列技术，用微阵列点样仪将生物素化的抗体固定于包被了亲和素(Streptavidin)的玻片载体上。每张玻片(25mmX73mm)被划分为16个膜块，每个膜块都含有80个抗体和8个对照蛋白。因此，每张芯片均含有16个包含了 80个抗体和8种对照蛋白的微阵列，每个膜块可同时检测80个样本。检测装置为一个有16个孔的橡胶分隔垫片和两个固定夹，橡胶分隔垫片与玻片大小一致，其孔的位置和大小与玻片上16个蛋白点样区的位置符合。检测时，首先将橡胶分隔片放置于玻片表面，用固定夹将玻片和橡胶分隔片固定在一起，将IuL样本与50uL样本稀释剂混合后，力口入橡胶分隔片的孔中进行反应，60min后弃反应液，加入IOOuL洗涤液，振荡洗涤3次，每次5min。然后加入荧光素Cy3标记的亲合素和荧光素Cy5标记的羊抗人IgG抗体(I: 1000稀释)，室温反应60min，吸去反应液，加入洗涤液洗3次，除去固定夹和分隔垫片，将玻片浸A PBS缓冲液中漂洗30s，低速离心(500rpm) 3min使玻片干燥。用激光扫描仪扫描玻片，扫描波长为535nm(Cy3)和632nm(Cy5)。图像用Gen印ix6.0软件分析，得出各点Cy3和Cy5的荧光强度，并以Cy3为内参算出各点的校正信号强度，然后用分析软件，计算出各个抗原的平均强度。
[0028]本发明可操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正，并生成对应样品信号强度的图表。
【权利要求】
1.一种检测人热休克蛋白(Hsp90a)的生物芯片及其检测方法，其特征在于它的检测装置是由玻片、橡胶分隔片和金属固定夹组成，橡胶分隔片设置在玻片上方，两侧分别插入金属固定夹的凹槽中，将玻片和橡胶分隔片固定在一起。
2.根据权利要求1所述的一种检测人热休克蛋白(Hsp90a)的生物芯片及其检测方法，其特征在于它的检测方法为:1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化:将玻片浸泡在一定浓度的亲合素溶液中，室温放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，离心干燥，放4°C冰箱备用；2、抗体蛋白与生物素交联:增加抗体的结合强度和灵活度；3、制备抗体芯片:将抗体稀释为lmg/mL，用喷射式微阵列点样仪将抗体点在玻片表面的NC膜上，每张玻片上分为16个膜块，每个膜块都含有80个抗体和8个对照蛋白，每个蛋白在每个膜块上重复点样两次，点样时湿度保持在75%，点样完毕后室温放置2h，然后真空包装；4、利用抗体芯片检测微量血液标本中人热休克蛋白(Hsp90a) ;5、数据分析:用对应的分析软件进行分析。
3.根据权利要求1所述的一种检测人热休克蛋白(Hsp90a)的生物芯片及其检测方法，其特征在于所述的橡胶分隔片厚度约1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16个孔，孔的位置和孔径与抗体点样区相当，将橡胶分隔片覆盖在芯片表面，抗体点样区位于各个孔的正中位置。
【文档编号】G01N33/68GK103760361SQ201310729381
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月14日 优先权日:2013年12月14日
【发明者】凌中鑫 申请人:凌中鑫