乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法
【专利摘要】本发明公开了乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法。其包括下述步骤：（1）制备待测样品：将乳基料去除脂肪和蛋白质并提取游离态氨基酸，得到待测样品；（2）衍生：将标准氨基酸和步骤（1）的待测样品分别进行衍生，衍生的条件如下：采用N-异丁酰基-L-半胱氨酸与邻苯二甲醛联合衍生，内标物为L-高精氨酸；（3）分离检测：采用高效液相色谱-荧光检测方法分离检测氨基酸，将待测样品的色谱图与标准氨基酸的色谱图比较，即可。本发明的检测方法采用高效液相色谱分离结合柱前手性试剂衍生和荧光检测法，检测限大大降低，能提高检测的分辨率和灵敏度，可以对乳基料中氨基酸组分进行手性构型的定性和定量分析。
【专利说明】乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品领域，尤其涉及乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法。
【背景技术】
[0002]近年来，乳制品食品安全事件引起社会广泛关注，由乳制品质量缺陷引发的食源性疾病明显增多，使得乳制品的质量安全问题受到广泛重视。食品科技的发展在丰富人类食品消费的同时，也给乳制品生产带来了安全问题。为了加强乳制品质量监管，《食品安全法》、《乳品质量安全监督管理条例》，《企业生产乳制品许可条件审查细则(2010版)》、《企业生产婴幼儿配方奶粉许可条件审查细则(2010版)》等法规相继出台，乳制品行业迫切需要更多的整体解决方案以满足日益增加的检测需求。众多的检测需求以及法规需求，同时也给乳制品分析实验室带来了如何细化完善检测指标、提高检测准确度灵敏度、提高实验室效率和降低分析成本的难题。
[0003]由于乳蛋白的氨基酸组成与人体需要颇为接近，因此被誉为“理想蛋白质”。牛乳中不仅蛋白质含量高，而且富含多种生物活性成分以及人体所需的各种氨基酸等。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，它参与生物体内的新陈代谢和生理过程。不同的氨基酸比例、排列方式组成不同类别的蛋白质，它们在维持机体组织生长、更新、参与各种化学反应、提供生理活动所需要的热能等方面发挥着重要作用。游离氨基酸是人体可直接吸收的营养成分，它的含量和成分能够部分地反映出食品的营养价值。
[0004]组成人体内生命物质的20种基本氨基酸，除甘氨酸外都有两种互成镜像的L型和D型结构。动物实验表明D-氨基酸可能阻断一些重要生理物质的合成，还能抑制动物的生长，D-氨基酸构成的蛋白质多肽通常不被或缓慢地被肽酶水解；肝、肾中的D-氨基酸氧化酶能使D-氨基酸脱氨转化从而消除其毒性。研究表明人体内的D-氨基酸多与老龄化组织如白内障晶体浑浊、早老痴呆患者脑白质和灰质、某些肾脏疾病有关。人体内D-氨基酸的来源一方面是体内胃肠道细菌本身含有以及L-氨基酸消旋化形成，另一方面是通过摄取体外的药物、食物带入。而目前已知可能含有D-氨基酸的食物包括海带、一些昆虫、海洋动物、苹果和梨等天然食物，以及生物处理的乳制品、饮料、调味品、腌制品、加工肠、酱菜等加工食品。目前，食品中的手性氨基酸的分析研究还很少，更不属于食品安全的常规检测项目。由此，D-氨基酸对食品的安全性有待深入研究，食物中氨基酸水平以及D-氨基酸水平的监测将可能成为食品营养学及食品安全领域的一个重要方面。
[0005]牛乳中含有少量的D-氨基酸是正常现象，如部分种类的D-氨基酸含量较高可能与细菌引起的乳房炎有一定关系，并且在一定时间范围内，D-氨基酸含量会随着牛乳存储期的延长而增加。因此，D-氨基酸含量可能可以作为乳制品细菌污染程度或货架期的一个指标。此外据报道健康牛初乳中D-氨基酸的含量较高，大约可达健康牛非初乳的5倍。
[0006]针对氨基酸检测，现有的氨基酸测定方法，多数使用茚三酮染色或衍生，采用分光光度计或氨基酸分析仪进行氨基酸的分析，也有部分采用高效液相色谱仪，但也需要使用特殊的离子交换色谱柱。现行国家标准GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》和GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》均采用全自动氨基酸分析仪；IS013903:2005 (E)《动物饲料-氨基酸含量的测定》使用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪测定动物饲料中的17种氨基酸(不包括色氨酸);AOAC官方方法994.12《饲料中氨基酸的测定-过甲酸氧化与焦亚硫酸钠-酸水解法》适用于用氨基酸分析仪测定16种氨基酸(包括蛋氨酸和胱氨酸,不包括酪氨酸和色氨酸)。以上标准方法均不涉及氨基酸手性异构体的测定。
[0007]氨基酸对映体的分离分析常用的有化学拆分法、膜拆分法、酶拆分法、萃取拆分法、诱导结晶法、毛细管电泳拆分法、色谱拆分法等。化学拆分法是把外消旋体与拆分剂作用生成两种非对映异构体盐，然后利用两种盐的溶解度差异来进行分离；膜拆分法主要依赖于氨基酸对映体与溶液中的金属阳离子及载有手性选择子的固定相形成三元配合物的稳定性差异，通常L型氨基酸形成的配合物比D型的稳定，待拆分的氨基酸外消旋体选择性吸附在手性渗透膜上，然后被吸附的氨基酸脱附，并通过浓度差驱动扩散至溶液中；酶拆分法是利用酶的高度立体专一性，在一定条件下只能催化外消旋体中的一个异构体反应生成非对映体从而实现对映异构体的分离；萃取拆分法利用溶质在两种互不相溶的溶剂相中溶解度的差异提取拆分；诱导结晶法利用氨基酸的某一旋光异构体在一定温度时较外消旋体溶解度小，易析出的性质，在外消旋体溶液中加入某种旋光异构体作为晶种，诱使与晶种相同的异构体优先析出，借此达到分离目的；毛细管电泳拆分法是利用各种不同带电性质和荷电量的分子在毛细管柱中电泳流和电渗流两种作用下迁移速度不同而实现分离的；色谱拆分法可以利用手性固定相色谱柱拆分、也可以利用流动相中添加了手性添加剂的非手性固定相色谱柱拆分、还可以利用手性试剂与被拆分物进行衍生化反应生成非对应异构体而实现分离。
[0008]这些方法各有优缺点:化学拆分法机制工艺最成熟，多用于工业上批量生产，但拆分产率和产品旋光纯度不高；膜拆分法能耗低、易于连续操作，但局限于膜的稳定性和使用寿命；酶拆分法高度立体专一，拆分产率高，产品光学纯度较高，反应条件温和，对环境友好，但酶制剂品种有限、保存条件苛刻、价格昂贵，而且这种方法以及基于这种方法的生物传感器法通常只能测得单一种类氨基酸的对映体含量或多种D-氨基酸的总量；萃取拆分法提取与分离效率高、分离效果好、需要设备简单，但局限于新型提取拆分剂的开发和选择；诱导结晶法设备简单，但操作繁琐，且只能应用于少部分能生成外消旋聚集体的分子；毛细管电泳拆分法分辨率高，但与前几种方法类似的，一次只能同时拆分一种或少数几种氨基酸；色谱拆分法方法多，适应氨基酸种类更广，能实现多种氨基酸的同时分离和分析，但手性色谱柱价格昂贵，因此该法主要集中在于手性试剂和分离条件的选择和开发。
[0009]采用高效液相色谱仪检测氨基酸时，由于大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特征，为提高分析检测的灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸进行柱前或柱后衍生。与氨基酸分析仪相比，柱前衍生具有快速灵敏、不需专用仪器等优点，通常采用邻苯二甲醛(0PA)、异硫氰酸苯酯(PITC)，氯甲酸-9-芴甲酯(FM0C-C1)、丹酰氯(dansyl-Cl)，2，4-二硝基氟苯(DNFB)，6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)等，由于OPA衍生步骤简单，反应速度快，剩余试剂不产生干扰，衍生物可用多种检测器检测，应用较为广泛。柱后衍生应用最广泛的是茚三酮，上述衍生试剂各有优劣。此外，采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测法可不经过衍生对氨基酸和碳水化合物等物质进行测定，检测的范围宽，使用较为方便。但该检测器对样品前处理要求比较严格，适用于成分比较单一或比较干净的样品的检测，成分复杂的样品则会对结果造成较大的干扰；在洗脱液雾化过程中需消耗大量的氮气，增加了测定成本；不能使用盐溶液作为流动相，会对检测造成干扰。
[0010]现有技术中，一般采用茚三酮柱后衍生法的氨基酸自动分析仪不能拆分手性异构体。对游离氨基酸的分析要准确定性和定量，一般要求两两分离度不低于1.0，最好大于
1.2，平均分离度一般大于1.5。对于某些种类的氨基酸，有些仪器的平均分离度较高的可以达到大于3.3。而一般的氨基酸自动分析仪最低检测限在2-8pmol (即使相对较灵敏的天门冬氨酸，也在3pmol左右，信噪比S/N=2或3)。
【发明内容】
[0011]本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有的氨基酸测定方法存在成本高、普适性差、难于拆分氨基酸手性异构体以及基于高效液相色谱仪的氨基酸测定方法难以满足快速准确地对多种基本氨基酸及其手性异构体进行同时的定性和定量分析的缺陷，提供一种乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法。
[0012]本发明采用IBLC (N-异丁酰基-L-半胱氨酸)作为手性试剂与OPA联合衍生，通过对生成的非对映立体异构体进行检测来间接检测手性氨基酸，既能实现氨基酸的手性拆分，又能提高检测的分辨率和灵敏度(本发明可以同时实现35种氨基酸的两两分离，两两分离度均在1.2或以上，平均分离度达3.7，表明分辨率较高；各种氨基酸的最低检测限为0.05pmol (S/N=3)，表明灵敏度较高)，而且这两种试剂也能很容易的从试剂公司购得标准品。本发明的检测方法集中对乳基料中的绝大部分基本氨基酸进行一次性、同时的系统分析，包括手性分析。此前的研究方法多集中在单个或少数几种氨基酸的手性分析和含量测定，对基本氨基酸的系统的一次性分析也多是利用氨基酸自动分析仪进行，这种方法不能得到手性构型的分析结果，另外方法的检测限也有所局限(现有技术中的检测限一般为2-8pmol)。本方法采用高效液相色谱分离结合柱前衍生和荧光检测法，检测限大大降低，最低检测限可达0.05pmol (即5X 10_14mol，信噪比S/N=3)，可以对乳基料中氨基酸组分进行手性构型的定性和定量分析。
[0013]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:
[0014]本发明提供了一种乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法，其包括下述步骤:
[0015](I)制备待测样品:将乳基料去除脂肪和蛋白质并提取游离态氨基酸，得到待测样品;
[0016](2)衍生:将标准氨基酸和步骤(I)的待测样品分别进行衍生，衍生的条件如下:采用N-异丁酰基-L-半胱氨酸与邻苯二甲醛联合衍生，内标物为L-高精氨酸；
[0017](3)分离检测:采用高效液相色谱-荧光检测方法分离检测氨基酸，将待测样品的色谱图与标准氨基酸的色谱图比较，即可；
[0018]其中，高效液相色谱的条件如下:流动相A为pH值为5.90?6.10、钠离子浓度为20?25mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液，流动相B为甲醇与乙腈的体积比为12:1的混合溶剂，以流动相A与流动相B按照下述体积比进行梯度洗脱:0min: (95?100)%A+(0?5)%B — 15min: (84 ?88)%A+(12 ?16)%B — (45 ?55)min: (75 ?78)%A+(22 ?25) %B — 90min: (30 ?46)%A+(54 ?70) %B — 95min: (30 ?46)%A+(54 ?70) %B ;流速为
0.6 ?lmL/min。[0019]本发明中，所述的乳基料一般是指本领域常用的生鲜乳、乳粉、复原乳或仅经过乳酸菌发酵的将用于进一步加工的发酵乳等。
[0020]其中，所述的将乳基料去除脂肪和蛋白质并提取游离态氨基酸可按本领域常规方法进行，较佳地通过下述步骤进行:将乳基料离心，撇去上层脂肪后，与0.lmol/L盐酸按照lg: (0.5?2)mL的比例混合均匀后再加入三氯乙酸使三氯乙酸终浓度为3?10%，静置使蛋白质完全沉淀，离心后取上清液，用孔径为0.22 滤膜过滤得到的滤液即为待测样品，更佳地通过下述步骤进行:将乳基料于4°C条件下以5000 X g离心30min，撇去上层脂肪后，与0.lmol/L盐酸按照lg:1mL的比例混合均匀后，再加入三氯乙酸使三氯乙酸终浓度为5%，振荡使充分混匀后于4°C静置4?24h使蛋白质完全沉淀(更佳的静置时间为12h)，再于4°C条件下以(9000?20000) Xg离心10?30min后取上清液(更佳地为15000Xg离心20min)，用孔径为0.22 U m滤膜过滤得到的滤液即为待测样品。待测样品于-85?_18°C保存(更佳地为不高于_80°C保存)；所述的终浓度是指质量百分比浓度。
[0021]本发明中，步骤(2)中，将标准氨基酸进行衍生较佳地通过下述步骤进行:用孔径为0.22 ii m滤膜过滤如下试剂:硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含200?300mmol/L N-异丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含150-200mmol/L邻苯二甲醛的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含0.3?0.5mmol/L内标物L-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有标准氨基酸的0.lmol/L HCl溶液，然后按照体积比13:1:1:1:8混合，振荡混匀，避光条件下静置发生衍生反应；所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01?0.5mol/L，pH值为10.0?10.8。步骤(2)中，将标准氨基酸进行衍生更佳地通过下述步骤进行:用孔径为0.22 pm滤膜过滤如下试剂:硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含260mmol/LN-异丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含170mmol/L邻苯二甲醛的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含0.4mmol/L内标物L-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有标准氨基酸的0.lmol/L HCl溶液，然后按照体积比13:1:1:1:8混合，振荡混匀，避光条件下静置发生衍生反应；所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01?0.5mol/L, pH值为10.0?10.8。
[0022]本发明中，步骤(2)中，将步骤(I)的待测样品进行衍生较佳地通过下述步骤进行:按照上述标准氨基酸衍生的方法，将所述的含有标准氨基酸的0.lmol/L HCl溶液替换为含有待测样品的0.lmol/L HCl溶液，即可。
[0023]上述步骤(2)中，所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度较佳地为0.05mol/L，pH值较佳地为10.4 ;所述的振荡较佳地采用旋涡振荡器进行振荡，振荡的时间较佳地为10?60s，更佳地为30s ;所述的衍生反应的时间较佳地为1.5?18min，更佳地为5min ;所述的衍生反应的温度较佳地为16-30°C，更佳为21?25°C。
[0024]本发明中，硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度是指共轭酸碱的总浓度。
[0025]发明人经过大量研究发现，N-异丁酰基-L-半胱氨酸(S卩IBLC,N-1sobutyryl-L-cysteine,又称N-异丁酰基_L_巯基丙氨酸)能与一级氨基酸再加上邻苯二甲醛反应生成具有荧光吸收的稳定产物。上述衍生反应条件温和，与氨基酸反应生成稳定的异吲哚类衍生物，衍生产物在室温下1.5-18min内稳定存在，有利于进行准确有效的检测。过量的IBLC不干扰测定。该衍生剂的特点和优势有利于准确有效的氨基酸测定，其作为一种精细化工原料，价格便宜，容易购得，有利于方法的推广应用。
[0026]其中，在所述的联合衍生中，应保证N-异丁酰基-L-半胱氨酸的终浓度使溶液中的氨基酸完全衍生，一般常规乳基料中总的游离态氨基酸含量为500~3000 u mol/L (其中对乳粉而言，此含量为复原为液态乳后的含量)，根据乳牛品种、产乳期是否初乳、产乳季节、饲喂饲料、乳中微生物数量以及加工方式不同，该含量有所差异，但据大量文献报道和本发明人研究发现，该含量范围主要集中在800~2000 y mol/L，本发明中所述的N-异丁酰基-L-半胱氨酸的最终加入量较佳地不低于总氨基酸最终加入量的2倍，所述的最终加入量为物质的量(摩尔数)。
[0027]其中，所述的高效液相色谱的色谱柱可采用本领域常规使用的各种色谱柱并配以保护柱，较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱和保护柱，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱较佳地为规格5 u m、150 X 4.6mm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述的保护柱较佳地为规格5 u m、12.5X4.6mm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。色谱柱的柱温较佳地为16~35°C，更佳地为25°C。进样量较佳地为6~50 μ L，更佳地为15 u L。
[0028]其中，所述的流动相A较佳地为pH值为5.98~6.02、钠离子浓度为23mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液。
[0029]其中，所述的流动相A与流动相B较佳地按照下述体积比进行梯度洗脱:0min:97%A+3%B — 15min: 85%A+15%B — 50min: 77%A+23%B — 90min: 40%A+60%B — 95min: 40%A+60%B。
[0030]其中，所述的流速较佳地为lmL/min。
[0031]其中，在所述的荧光检测方法中，荧光检测器的激发波长较佳地为220~250nm，更佳地为230nm ;所述的突光检测器的发射波长较佳地为415~485nm,更佳地为445nm。
[0032]步骤(3)中，得 到标准氨基酸的色谱图和待测样品的色谱图后，还可以进一步通过绘制标准曲线来计算乳基料中各氨基酸的含量:通过标准氨基酸的色谱图，以某种标准氨基酸(sAAx)与内标物L-高精氨酸的色谱峰面积之比值(AsAAx/\_h_)对反应体系中该标准氨基酸与内标物L-高精氨酸的最终加入量之比值(NsMx/\_h_)作图拟合作标准曲线，并通过待测样品的色谱图计算待测样品的该氨基酸(AAx)与内标物L-高精氨酸的色谱峰面积之比值(AAAx/\_H_)，通过标准曲线得出待测样品中对应的该氨基酸的最终加入量和内标物最终加入量的比值(NAAx/\_H_)，从而得到待测样品中该氨基酸的含量。
[0033]本发明中，L-Homo(L-homoarginine)即是指内标物L-高精氨酸，0PA(o_phthalicaldehyde)即是指邻苯二甲醒。
[0034]本发明中，所述的氨基酸较佳地包括L-天门冬氨酸、D-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、D-谷氨酸、L-丝氨酸、D-天冬酰胺、D-丝氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-苏氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、D-苏氨酸、D-组氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、D-精氨酸、D-丙氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、D-甲硫氨酸、D-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、D-色氨酸、D-苯丙氨酸、L-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-亮氨酸、L-赖氨酸和D-赖氨酸中的一种或多种。
[0035]本发明中所述的IBLC、OPA和氨基酸标准品(17种构成蛋白质的基本氨基酸及其手性异构体、甘氨酸以及作为内标物的L-高精氨酸)均为纯度> 97%的标准试剂(更佳地为> 99%、手性化合物的光学纯度> 99.5%);盐酸、乙酸、乙酸钠和三氯乙酸等的纯度可采用本领域常规使用的纯度，较佳地为分析纯；甲醇和乙腈的纯度为本领域常规使用纯度，较佳地为色谱纯；除特殊说明外所有配制溶液的水按本领域常规均为超纯水(电阻率达
18.2MQ ? cm)。[0036]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0037]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0038]本发明的积极进步效果在于:
[0039](I)本发明可集中对乳基料中的绝大部分基本氨基酸进行一次性、同时的系统分析，包括手性分析。通过采用IBLC (N-异丁酰基-L-半胱氨酸)作为手性试剂与OPA联合衍生，结合HPLC和通用的C18液相色谱柱，能够对乳基料中除脯氨酸和半胱氨酸以外的18种生物体构成蛋白质的基本氨基酸进行一次性手性分离，再通过对生成的非对映立体异构体进行荧光检测来实现对分离得到的35种氨基酸的同时测定(其中甘氨酸不存在手性异构体)，该方法有助于对乳制品营养和质量指标的细化及其相关检测方法的建立。
[0040](2)本发明的检测方法采用高效液相色谱分离结合柱前手性试剂衍生和荧光检测法，检测限大大降低，最低检测限可达0.05pmol (即5X10_14mol，信噪比S/N=3)，能提高检测的分辨率和灵敏度，可以对乳基料中氨基酸组分进行手性构型的定性和定量分析。而此前的研究方法多集中在单个或少数几种氨基酸的手性分析和含量测定，对基本氨基酸的系统的一次性分析也多是利用氨基酸自动分析仪进行，这种方法不能得到手性构型的分析结果，另外方法的检测限也有所局限。
[0041](3)本发明的检测方法普适性更强，而且不需要昂贵的氨基酸分析仪和/或昂贵的氨基酸测定试剂包，适用于更多的常规实验室。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为36种标准氨基酸衍生物色谱图(其中加入的L-氨基酸的浓度为8 U mol/L,L-高精胺酸为0.4mmol/L, D-氨基酸和甘氨酸均为4 y mol/L，最终进样量分别为40，250，20 和 20pmol)。
[0043]图2为实施例2生乳样品中的17种氨基酸及其手性异构体和甘氨酸的HPLC测定曲线图谱(其中加入的内标物L-高精氨酸的浓度为0.4mmol/L，最终进样量为250pmol)。
【具体实施方式】
[0044]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0045]本发明的实施例采用的试验条件如下:
[0046]检测仪器:Agilentl260高效液相色谱系统，G1329B100孔自动进样装置，AgilentG1321B荧光检测器；
[0047]色谱柱:美国安捷伦公司的XDB C18 (150X4.6_，5 y m)液相色谱柱，保护柱为美国安捷伦公司的XDB C18 (12.5X4.6mm, 5 u m)分析保护柱；
[0048]柱温:25°C；
[0049]流动相:流动相A为钠浓度23mmol/L的乙酸/乙酸钠缓冲液(pH值为
6.00±0.02)，流动相B为甲醇/乙腈混合溶剂(v:v=12:1)，流速为lmL/min ；
[0050]检测波长:设定激发波长为230nm,发射波长445nm ；[0051]进样量:15iiL。
[0052]洗脱程序:
[0053]
【权利要求】
1.一种乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法，其包括下述步骤:(I)制备待测样品:将乳基料去除脂肪和蛋白质并提取游离态氨基酸，得到待测样品； (2)衍生:将标准氨基酸和步骤(1)的待测样品分别进行衍生，衍生的条件如下:采用N-异丁酰基-L-半胱氨酸与邻苯二甲醛联合衍生，内标物为L-高精氨酸； (3)分离检测:采用高效液相色谱-荧光检测方法分离检测氨基酸，将待测样品的色谱图与标准氨基酸的色谱图比较，即可； 其中，高效液相色谱的条件如下:流动相A为pH值为5.90~6.10、钠离子浓度为20~25mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液，流动相B为甲醇与乙腈的体积比为12:1的混合溶剂，以流动相A与流动相B按照下述体积比进行梯度洗脱:0min: (95~100)%A+(0~5)%B — 15min: (84 ~88)%A+(12 ~16)%B — (45 ~55)min: (75 ~78)%A+(22 ~25) %B — 90min: (30 ~46)%A+(54 ~70) %B — 95min: (30 ~46)%A+(54 ~70) %B ;流速为0.6 ~lmL/min。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的将乳基料去除脂肪和蛋白质并提取游离态氨基酸通过下述步骤进行:将乳基料离心，撇去上层脂肪后，与0.lmol/L盐酸按照Ig: (0.5~2)mL的比例混合均匀后再加入三氯乙酸使三氯乙酸终浓度为3~10%，静置使蛋白质完全沉淀，离心后取上清液，用孔径为0.22 滤膜过滤得到的滤液即为待测样品；所述的终浓度是指质量百分比浓度；较佳地通过下述步骤进行:将乳基料于4°C条件下以5000 Xg离心30min,撇去上层脂肪后，与0.lmol/L盐酸按照lg:1mL的比例混合均匀后，再加入三氯乙酸使三氯乙酸终浓度为5%，振荡使充分混匀后于4°C静置4~24h使蛋白质完全沉淀，再于4°C条件下以(9000~20000) Xg离心10~30min后取上清液，用孔径为0.22 滤膜过滤得到的滤液即为待测样品；所述的静置的时间较佳地为12h，所述的离心的条件较佳地为15000Xg离心20min。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，将标准氨基酸进行衍生通过下述步骤进行:用孔径为0.22 y m滤膜过滤如下试剂:硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含200~300mmol/L N-异丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含150-200mmol/L邻苯二甲醛的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含0.3~0.5mmol/L内标物L-高精氨酸的0.lmol/LHCl溶液以及含有标准氨基酸的0.lmol/L HCl溶液，然后按照体积比13:1:1:1:8混合，振荡混匀，避光条件下静置发生衍生反应；所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01~0.5mol/L, pH值为10.0~10.8 ;步骤(2)中，将标准氨基酸进行衍生较佳地通过下述步骤进行:用孔径为0.22 y m滤膜过滤如下试剂:硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含260mmol/L N-异丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含170mmol/L邻苯二甲醛的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含0.4mmol/L内标物L-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有标准氨基酸的0.lmol/L HCl溶液，然后按照体积比13:1:1:1:8混合，振荡混匀，避光条件下静置发生衍生反应；所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01~0.5mol/L, pH值为10.0~10.8 ; 和/或，步骤(2)中，将步骤(1)的待测样品进行衍生通过下述步骤进行:按照所述的标准氨基酸进行衍生的方法，其中，将所述的含有标准氨基酸的0.lmol/L HCl溶液替换为含有待测样品的0.lmol/L HCl溶液，即可。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH值为10.4 ;所述的振荡采用旋涡振荡器进行振荡，振荡的时间为10~60s，较佳地为30s ;所述的衍生反应的时间为1.5~18min，较佳地为5min ;所述的衍生反应的温度为16-30°C，较佳为21~25°C。
5. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱和保护柱，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱较佳地为规格5umU50X4.6mm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述的保护柱较佳地为规格5 y m、12.5X4.6mm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；色谱柱的柱温较佳地为16~35°C，更佳地为25°C ;进样量较佳地为6~50 ii L，更佳地为15 u L。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的流动相A为pH值为5.98~6.02、钠离子浓度为23mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液； 和/或，所述的乳基料为生鲜乳、乳粉、复原乳或仅经过乳酸菌发酵的将用于进一步加工的发酵乳。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的流动相A与流动相B按照下述体积比进行梯度洗脱:0min:97%A+3%B — 15min:85%A+15%B — 50min: 77%A+23%B — 90min:40%A+60%B — 95min:40%A+60%B ； 和/或，所述的流速为lmL/min。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述的荧光检测方法中，荧光检测器的激发波长为220~250nm，较佳地为230nm ;荧光检测器的发射波长为415~485nm，较佳地为445nm。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，得到标准氨基酸的色谱图和待测样品的色谱图后，还进一步通过绘制标准曲线来计算乳基料中各氨基酸的含量:通过标准氨基酸的色谱图，以某种标准氨基酸与内标物L-高精氨酸的色谱峰面积之比值对反应体系中该标准氨基酸与内标物L-高精氨酸的最终加入量之比值作图拟合作标准曲线，并通过待测样品的色谱图计算待测样品的该氨基酸与内标物L-高精氨酸的色谱峰面积之比值，通过标准曲线得出待测样品中对应的该氨基酸的最终加入量和内标物最终加入量的比值，从而得到待测样品中该氨基酸的含量。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的氨基酸包括L-天门冬氨酸、D-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、D-谷氨酸、L-丝氨酸、D-天冬酰胺、D-丝氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-苏氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、D-苏氨酸、D-组氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、D-精氨酸、D-丙氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-纟颜氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、D-甲硫氨酸、D-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、D-色氨酸、D-苯丙氨酸、L-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-亮氨酸、L-赖氨酸和D-赖氨酸中的一种或多种。
【文档编号】G01N30/06GK103645266SQ201310743057
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】游春苹, 郭本恒, 刘振民, 吴正钧, 任婧, 杭锋 申请人:光明乳业股份有限公司