一种测定发酵液中纳他霉素含量的双波长紫外分光光度法
【专利摘要】本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种测定发酵液中纳他霉素含量的双波长紫外分光光度法。所述包括步骤：（1）取处理好的待测样品，以70%甲醇-水溶液作为空白，分别测定其在303nm、290nm处的吸光值；（2）计算纳他霉素含量，C样品=(k×ΔA+b)×N。该方法的精密度、准确度考察、检测限及定量限都得到了有效评估，从而确保了方法的科学准确。
【专利说明】一种测定发酵液中纳他霉素含量的双波长紫外分光光度法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种测定发酵液中纳他霉素含量的双波长紫外分光光度法。
【背景技术】
[0002]纳他霉素是一种二十六元环多烯大环内脂类抗真菌剂，专性的抑制酵母菌和霉菌，被广泛用作天然生物性食品防腐剂和抗菌添加剂。纳他霉素(Natamycin)又名匹马霉素(Pimaricin),主要由链霉素菌属中的纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanovgensis)和褐黄抱链霉菌(StreptomycesgiIvosporeus)等产生菌经过发酵提炼精制而成。
[0003]在生物发酵过程中，发酵液中会产生大量的有机物质，如蛋白质及一些代谢产物，会给样品的测定带来干扰。HPLC法可以将相关的一些物质分离开，但是由于HPLC系统比较复杂，运行费用及人员要求较高，尤其是对样品的预处理要求较为严格，不适用于大量生物发酵样品的检测。
[0004]美国药典中纳他霉素成品的含量测定是采用高效液相色谱法，国内也有采用该法测定纳他霉素的报道，但这一方法对于纳他霉素高产菌的大规模选育和发酵过程的在线和快速离线检测具有明显缺点，如测定周期较长，样品处理及仪器要求较高，不适合大批量样
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[0005]国内也有采用紫外分光光度法快速测定发酵液中纳他霉素的报道，但由于纳他霉素发酵液是由生物发酵得到的，发酵培养基中使用了许多有机物质，这些物质中含有其他一些有紫外吸收的物质，在用紫外分光光度法测定时会对测定结果产生一定的干扰，单波长紫外分光光度法难以排除发酵液中各种杂质对测定结果的干扰。
【发明内容】
[0006]因此，本发明的目的是提供一种测定发酵液中纳他霉素含量的双波长紫外分光光度法，既能保证测定速度，又能有效排除杂质的干扰从而保证测定准确度。
[0007]根据本发明的测定发酵液中纳他霉素含量的双波长紫外分光光度法，包括步骤:
[0008](I)取处理好的待测样品，以70%甲醇-水溶液作为空白，分别测定其在303nm、290nm处的吸光值；
[0009](2)计算纳他霉素含量
[0010]C 样品=(k X Λ A+b) X N
[0011 ] Cg:样品中纳他霉素的含量(U g/ml) ； Δ A:样品溶液在303nm和290nm处吸光值的差值；k:标准曲线的斜率；b:标准曲线的截距；N:待测样品的稀释倍数。
[0012]根据本申请的方法，对纳他霉素标准品、纳他霉素发酵液样品进行全波长扫描，纳他霉素的最大吸收分别为290nm、303nm、319nm,而发酵液中的干扰物质在纳他霉素最大吸收波长290nm、303nm处的吸收值分别为0.051和0.047，基本没有变化，且与纳他霉素的吸收值相差较大，因此可以选定290nm、303nm做为纳他霉素含量测定波长，在此处杂吸收的ΔΑλ2_λ1 ^ O，因此可以最大限度地消除杂吸收的干扰。
[0013]根据本申请的测定发酵液中纳他霉素含量的双波长紫外分光光度法，该方法的精密度、准确度考察、检测限及定量限都得到了有效评估，从而确保了方法的科学准确。对发酵过程中的发酵单位分别采用双波长紫外分光光度法与高效液相色谱法(HPLC测定方法采用美国药典29版方法)进行跟踪测定，对二者的结果进行分析比较，以确定两种方法是否
有显著差异。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
[0015]1.材料与设备
[0016]电子天平(万分之一)，紫外分光光度仪，超声清洗器，纳他霉素对照品(美国药典委员会)，纳他霉素发酵液样品。
[0017]2.发酵条件
[0018]斜面培养基(%):蛋白胨0.05，麦芽抽提物0.3，葡萄糖1.0，琼脂2.0，ρΗ7.0 ；
[0019]种子培养基(%):蛋白胨0.6，玉米浆0.6，葡萄糖2.0，氯化钠1.0，ρΗ7.0 ;
[0020]发酵培养基(%):玉米淀粉2.0，酵母浸出粉0.5，蛋白胨0.5，葡萄糖4.0，ρΗ7.0。
[0021]将于28°C培养的斜面培养物挖块适量接种于盛有25ml种子培养基的种子瓶中，28°C，200rpm培养24~36h，按照10%接种量接种于30L的全自动发酵罐中，28 °C，通气量20L/min培养144h，从72h起每隔8h取样即得纳他霉素发酵液样品。
[0022]3.样品的预处理
[0023]取2ml发酵液于具塞三角瓶中，加入25ml甲醇，超声处理30min，用滤纸过滤，除去菌渣。取滤液适量，用70%甲醇-水适当稀释后即得待测样品(稀释后样品中纳他霉素含量应在 0.5 ~6.0 μ g/ml )。
[0024]4.标准曲线
[0025]标准溶液:准确称取适量纳他霉素标准品，用甲醇超声溶解，再用70%甲醇-水稀释到适宜浓度备用。
[0026]以70%甲醇-水溶液对标准溶液进行稀释，浓度分别为0.5 μ g/ml、1.0 μ g/ml、
2.0 μ g/ml、3.0 μ g/ml>4.0 μ g/ml、5.0 μ g/ml、6.0 μ g/ml,以 70% 甲醇-水溶液作为空白，分别测定它们在303nm、290nm处的吸光值。以标准稀释溶液浓度为纵坐标，波长303nm、290nm处吸光值的差值Λ A做为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=19.33x+0.022，相关系数R2=0.999，在0.5~6.0 μ g/ml范围内线性良好。
[0027]5.样品的测定
[0028]取处理好的待测样品，以70%甲醇-水溶液作为空白，分别测定其在303nm、290nm处的吸光值。
[0029]6.纳他霉素含量的计算
[0030]C 样品=(k X Λ A+b) X N
[0031]ο:样品中纳他霉素的含量(U g/ml) ； ΔΑ:样品溶液在303nm和290nm处吸光值的差值；k:标准曲线的斜率；b:标准曲线的截距；N:待测样品的稀释倍数。[0032]例如:
[0033]某发酵液样品的ΛΑ为0.156，稀释倍数为1000倍，根据标准曲线y=19.33x+0.022，即可计算出该发酵液样品中那他霉素的含量为3037 μ g/ml即3.04g/L ；
[0034]某发酵液样品的ΛΑ为0.195，稀释倍数为5000倍，根据标准曲线y=19.33x+0.022，即可计算出该发酵液样品中那他霉素的含量为18955 μ g/ml即18.96g/L ；
[0035]某发酵液样品的ΛΑ为0.233，稀释倍数为10000倍，根据标准曲线y=19.33x+0.022，即可计算出该发酵液样品中那他霉素的含量为45260 μ g/ml即45.26g/L0
[0036]7.精密度
[0037]每个样品应取三份平行试样进行分析测定，相对误差不应超过5.0%，三者的平均值为最终的纳他霉素含量测定值。
[0038]分别用标准品溶液配制含量约为2.0 μ g/ml,3.0 μ g/ml,4.0 μ g/ml的标准品溶液，以甲醇-水(70%)做为空白溶液，用紫外分光光度法分别测定3次，实验结果见下表。
[0039]紫外分光光度法的测定精密度
[0040]
【权利要求】
1.一种测定发酵液中纳他霉素含量的双波长紫外分光光度法，其特征在于，所述方法包括步骤: (1)取处理好的待测样品，以70%甲醇-水溶液作为空白，分别测定其在303nm、290nm处的吸光值； (2)计算纳他霉素含量 C样品= (kX ΔΑ+b) XN C样品:样品中纳他霉素的含量μ g/ml ；ΔΑ:样品溶液在303nm和290nm处吸光值的差值；k:标准曲线的斜率；b:标准曲线的截距；N:待测样品的稀释倍数。
【文档编号】G01N21/33GK103698292SQ201310745222
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】詹志春, 王冠, 徐丽 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司