一种辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法
【专利摘要】一种辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法。其特征是本发明利用过碘酸钠法，对合成的无色孔雀石绿免疫原，用辣根过氧化物酶对其进行标记。该标记方法是由无色孔雀石绿免疫原和辣根过氧化物酶在室温条件下，在低pH条件下，用过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶的糖链，形成的醛化酶可与无色孔雀石绿免疫原的氨基相连，然后进一步用硼氢化钠还原成稳定的酶标记免疫原，获得的酶标记免疫原经过50%饱和硫酸铵沉淀,用磷酸盐缓冲液溶解，经透析后，即可获得辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原。本发明成功地合成了可用于检测无色孔雀石绿残留的酶标记免疫原，并且，为开发孔雀石绿药物残留酶联免疫检测方法奠定了基础，还有利于普及推广应用。
【专利说明】一种辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种辣根过氧化物酶标记免疫原的制备方法，特别是涉及一种辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前在无色孔雀石绿检测中，常见的标记方法都是对抗体进行标记，但抗体的标记存在着标记后抗体的效价下降较大的不足，不利于无色孔雀石绿残留检测。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是要提供一种改进的辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法，它不但能有效地制得用于无色孔雀石绿残留检测的酶标记无色孔雀石绿免疫原，而且操作简单，标记效果理想。
[0004]本发明的目的是这样实现的:本发明的一种辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法操作如下，在室温条件下:
(1)称取5mg辣根过氧化物酶放入IOmL离心管中，加入ImL双蒸水溶解，接着缓慢振荡中缓缓加入0.2mL新鲜配置的0.lmol/L过碘酸钠溶液，室温下避光反应20min，将反应后的液体装入透析袋中，再放入lmmol/L pH4.4醋酸钠缓冲液中，4°C暗处透析24h，期间换液4次，然后收集透析袋内的液体，得透析好的辣根过氧化物酶溶液；
(2)先在ImL无色孔雀石绿免疫原溶液中加入0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，将pH调整到9.1，再将步骤(I)透析好的辣根过氧化物酶溶液用0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液调节PH到9.1，并加入上述调整pH后的无色孔雀石绿免疫原溶液中，室温下避光反应2h，在反应结束后的溶液中加入100 μ L新配置的4mg/mL硼氢化钠溶液，4°C放置2h，得结合物；
(3)取步骤(2)所得结合物并加入等体积饱和硫酸铵,混勻，4°C放置30min,3000rpm离心30min,弃上清,沉淀以3mL0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液溶解,装入透析袋,在200mL以上的0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中4°C暗处透析24h，期间换液4次，得透析物；
(4)取步骤(3)所得透析物，3000rpm离心30min，除去不溶物，即得辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原。
[0005]所述的透析袋是半周长为22mm，截留分子量为14000的透析袋。
[0006]本发明利用过碘酸钠法，对合成的无色孔雀石绿免疫原，用辣根过氧化物酶对其进行标记，该标记方法是由无色孔雀石绿免疫原和辣根过氧化物酶在室温条件下，在低PH条件下，用过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶的糖链，形成的醛化酶可与无色孔雀石绿免疫原的氨基相连，然后进一步用硼氢化钠还原成稳定的酶标记免疫原，获得的酶标记免疫原经过50%饱和硫酸铵沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解，经透析后，即可获得辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原。在所得辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原中加入灭菌甘油至40%?50%浓度，_20°C冻存且可保存备用。
[0007]所使用无色孔雀石绿免疫原且购自上海佩吉生物科技有限公司。[0008]本发明采用了过碘酸钠法，本发明的辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法，且制备过程得到了简化，标记效果理想，用此方法制备得到的酶标无色孔雀石绿免疫原，可用于检测无色孔雀石绿残留的酶标记免疫原，在无色孔雀石绿残留的检测中，大大降低了方法的检测限，对提高无色孔雀石绿药物残留酶联免疫检测方法的准确度和灵敏度有了可靠的保证，该方法成功地合成了可用于检测无色孔雀石绿残留的酶标记免疫原，并且，为开发孔雀石绿药物残留酶联免疫检测方法奠定了基础，还有利于普及推广应用。
【具体实施方式】
[0009]以下将对本发明的辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法作进一步的详细描述。
[0010]具体步骤如下:
(1)称取5mg辣根过氧化物酶放入IOmL离心管中，加入ImL双蒸水溶解，接着缓慢振荡中缓缓加入0.2mL新鲜配置的0.lmol/L过碘酸钠溶液，室温下避光反应20min，将反应后的液体装入透析袋中，再放入lmmol/L pH4.4醋酸钠缓冲液中，4°C暗处透析24h，期间换液4次，然后收集透析袋内的液体，得透析好的辣根过氧化物酶溶液；
(2)先在ImL无色孔雀石绿免疫原溶液中加入0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，将pH调整到9.1，再将步骤(I)透析好的辣根过氧化物酶溶液用0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液调节PH到9.1，并加入上述调整pH后的无色孔雀石绿免疫原溶液中，室温下避光反应2h，在反应结束后的溶液中加入100 μ L新配置的4mg/mL硼氢化钠溶液，4°C放置2h，得结合物；
(3)取步骤(2)所得结合物并加入等体积饱和硫酸铵,混勻，4°C放置30min,3000rpm离心30min,弃上清,沉淀以3mL 0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液溶解,装入透析袋,在200mL以上的0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中4°C暗处透析24h，期间换液4次，得透析物；
(4)取步骤(3)所得透析物，3000rpm离心30min，除去不溶物，即得辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原。
[0011]上述各步骤均在室温下进行，所用透析袋均是半周长为22mm，截留分子量为14000的透析袋。
【权利要求】
1.一种辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法，其特征在于通过下列方法制得:在室温条件下 (1)称取5mg辣根过氧化物酶放入IOmL离心管中，加入ImL双蒸水溶解，接着缓慢振荡中缓缓加入0.2mL新鲜配置的0.lmol/L过碘酸钠溶液，室温下避光反应20min，将反应后的液体装入透析袋中，再放入lmmol/L pH4.4醋酸钠缓冲液中，4°C暗处透析24h，期间换液4次，然后收集透析袋内的液体，得透析好的辣根过氧化物酶溶液； (2)先在ImL无色孔雀石绿免疫原溶液中加入0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，将pH调整到9.1，再将步骤(I)透析好的辣根过氧化物酶溶液用0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液调节PH到9.1，并加入上述调整pH后的无色孔雀石绿免疫原溶液中，室温下避光反应2h，在反应结束后的溶液中加入100 μ L新鲜配置的4mg/mL硼氢化钠溶液，4°C放置2h,得结合物； (3)取步骤(2)所得结合物并加入等体积饱和硫酸铵,混勻，4°C放置30min,3000rpm离心30min,弃上清,沉淀以3mL 0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液溶解,装入透析袋,在200mL以上的0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中4°C暗处透析24h，期间换液4次，得透析物； (4)取步骤(3)所得透析物，3000rpm离心30min，除去不溶物，即得辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原。
2.根据权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记无色孔雀石绿免疫原的制备方法，其特征在于所述的透析袋是半周长为22_，截留分子量为14000的透析袋。
【文档编号】G01N33/535GK103728448SQ201310747526
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】杨先乐, 梁楠, 柯江波, 胡利静, 刘腾飞 申请人:上海海洋大学