用于慢性hbv患者的反应预测和疗法监测的hbv免疫复合物的制作方法

用于慢性hbv患者的反应预测和疗法监测的hbv免疫复合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于将患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的方法，所述方法包括步骤：a)确定所述受试者的样品中HBV免疫复合物的量，b)将步骤a)中获得的HBV免疫复合物的量与参考值比较，和c)基于步骤b)中比较的结果，将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感。本发明进一步涉及确定来自患有HBV感染的受试者的样品中HBV免疫复合物的量的用途和HBV免疫复合物的检测剂用于将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的用途。另外，本发明涉及可将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的装置和试剂盒。
【专利说明】用于慢性HBV患者的反应预测和疗法监测的HBV免疫复合 物
[0001] 本发明涉及诊断学领域。特别地，它涉及用于将患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的 受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的方法，所述方法包括步骤：a)确定所述受试者的样品中 HBV免疫复合物的量，b)将步骤a)中获得的HBV免疫复合物的量与参考值比较，和c)基于 步骤b)中比较的结果，将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感。本发明进一步 涉及确定来自患有HBV感染的受试者的样品中HBV免疫复合物的量的用途和HBV免疫复合 物的检测剂的用途，用于将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感。另外，本发明 涉及允许将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的装置和试剂盒。
[0002] 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV)引起的肝脏传染性炎性疾病。该病毒因暴露于 体液而传播，通过输血、透析、毒品成瘾者共用针头和围产期感染传播是主要的传播模式。
[0003] 急性乙型肝炎病毒感染以肝脏炎症、呕吐和黄疸为特征。症状一般持续几周并且 随后逐渐改善，同时免疫系统清除感染。完全康复和建立保护性免疫的概率随年龄而增加： 尽管仅5 %成人将患有持续多于数周的持续性感染，即慢性HBV感染，但是对于幼儿，这种 比率升至70%、并且对于围产期感染的新生儿，升至95%。
[0004] 慢性HBV与形成肝硬化和肝癌的严重风险相关，这是为何HBV已经由WHO国际癌 症研究机构（WHO, s International Agency for the Research on Cancer，IARC)划归为 I类致癌原，即对人致癌的病原体。因此对患者而言接受治疗允许患者的免疫系统清除感染 的治疗是极为重要的。常见治疗方案包括抑制病毒DNA聚合酶的核苷或核苷酸类似物，连 同干扰素 α。一项重要改进是将peg化干扰素（例如Pegasys?])引入疗法，从而提供 延长的干扰素半寿期。关于HBV感染的流行病学和治疗的综述，见J.L.Dienstag N Engl J Med 2008, 359 ; 1486-1500。
[0005] 慢性HBV感染的血清学是复杂的，因为在一方面，抗HBV高滴度与疾病的严重性直 接相关，但在另一方面，发现抗HBV e抗原抗体在自发性血清转换（即从血清清除HBV e抗 原）多年前即存在于患者中（Maruyama等人，（1993)，J. Clin. Invest. 91，2586-2595)。尽管 治疗改进，但仍仅一部分患者将经过治疗清除感染，而其他患者将不清除。第二组患者（非 反应个体）的成员常常可以在更激进的治疗方案（例如剂量增加、治疗延长或额外用药） 下清除感染。因此将需要能够预测患者对标准干扰素治疗的反应，目的在于从一开始就可 以调整治疗。在最近的改进中，发现在12周治疗后确定患者样品中HBV可溶性抗原（HBsAg) 的变化允许利用临界值预测疗法成效。然而，临界值仅对还存在HBV e抗原（HBeAg)阳性 的患者有效，所致患者主要是亚太地区患者中的病例。在例如欧洲主要为HBeAg阴性的患 者中，临界值非常难以限定，使用在疗法启动和第12周之间至少10%的下降作为临时替代 物。
[0006] 最近，据报道在HBeAg阳性患者中，在疗法启动之前高含量的包含HBsAG和抗 HBsAg-IgG的HBV复合物与对标准干扰素疗法的良好反应相关。然而，这不允许预测HBeAg 阴性患者。总之，目前没有这样的方法，所述方法将允许在治疗启动之前对全部患者组预测 疗法成效，无论他们的HBeAg状态如何。
[0007] 因此，作为本发明基础的技术问题可以视为提供用于符合前述需要的手段和方 法。这个技术问题通过权利要求中及下文表征的实施方案解决。
[0008] 因此，本发明涉及一种用于将患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的受试者鉴定为对干 扰素治疗敏感的方法，所述方法包括步骤：
[0009] a)确定所述受试者的样品中HBV免疫复合物的量，
[0010] b)将步骤a)中获得的HBV免疫复合物的量与参考值比较；并且
[0011] c)基于步骤b)中比较的结果，将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏 感。
[0012] 本发明的方法优选地是一种体外方法。另外，它可以包括除上文明确提到的那些 之外的步骤。例如，其他步骤可以例如涉及预处理步骤a)的样品或评价由该方法获得的结 果。另外，可以使用内部对照，如样品质量对照或性能对照。该方法可以手工地实施或由自 动化辅助。优选地，步骤（a)至（c)可以总体上或部分地由自动化辅助，例如由用于确定步 骤（a)中HBV免疫复合物的合适机器人设备和感知设备辅助。
[0013] 如本文所用，术语"鉴定"意指将受试者划入对干扰素治疗敏感的受试者组（所谓 "反应个体")，或划入对干扰素治疗不敏感的受试者组（所谓"非反应个体")。如本领域技术 人员将理解，前述鉴定通常不旨在对于待分析的受试者达到100%正确。然而，本术语要求 评估将对统计显著部分的待分析的受试者有效。本领域技术人员可容易地使用各种熟知的 统计评价工具（例如，置信区间确定、P -值测定、student氏t-检验、Mann-Whitney检验等） 确定某个部分是否为统计显著。详见Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wi ley&Sons, New York 1983。优选的置信区间是至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 % 或至少99%。p-值优选地是0. 1、0. 05、0. 01、0. 005或0. 0001。优选地，本发明构思的概率 允许这种区分将对给定族群或群体的至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %受试者是 正确的。
[0014] 优选地，根据本发明方法的鉴定可以在不知晓受试者的HBV e抗原状态的情况下 实现，即这种鉴定导致将受试者正确划分至对干扰素治疗敏感的受试者组或对干扰素治疗 不敏感的受试者组，无论所研究受试者的HBeAg状态如何。因而，该方法可以适用于血清样 品中具有可检测量的HBeAg的受试者以及适用于血清样品中没有可检测量的HBeAg的受试 者。
[0015] 术语"乙型肝炎病毒（HBV) "指来自嗜肝DNA病毒科的作为乙型肝炎的致病因子的 病毒物种。HBV病毒粒子由外膜（也称作脂质包膜）、二十面体核衣壳和DNA基因组组成。 HBV在本领域中熟知并已得到表征。
[0016] 术语"乙型肝炎病毒感染"或"HBV感染"指HBV在受试者中的可检测存在。优 选地，通过在来自受试者的样品中检测出至少一种病毒多肽诊断HBV存在，更优选地，检测 至少一种病毒抗原 HBs (HBsAg，Genbank 登录号 AAL66340. 1 GI: 18252577, SEQ ID NO: 1)， HBc (HBcAg，Genbank 登录号 CAA51257. 1 GI: 288930, SEQ ID NO: 2)和 HBe (HBeAg，Genbank 登录号AAM96930. 1 GI:22530876，SEQ ID N0:3)。技术人员理解，将HBV多肽作为生物标 记提及，不作为具体多肽提及，并且术语HBV涵盖可能包含前述HBV多肽的序列变体的各 种HBV毒株。因此，具有以GenBank登录号保藏的具体序列的前述多肽应理解为代表生物 标记的示例性序列。根据本发明还涵盖变体多肽，所述变体多肽因至少一个氨基酸添加、 置换和/或缺失而与具体序列的多肽不同，只要它们也合适作为如上文讨论的HBV感染的 生物标记。优选地，变体多肽与具体多肽同一至少70%、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。如本文所用，术语"同一"指以如下为特征 的序列同一性：确定两个核酸序列或氨基酸序列之间相同氨基酸的数目，其中比对所述序 列以获得最高等级的匹配。可以使用在计算机程序中代码化的公开技术或方法如，例如 BLASTP、BLASTN或FASTA(Altschull990，JMolBiol 215,403)来计算。在一个方面，在 整个氨基酸序列范围内计算同一性百分数值。对于技术人员，一系列基于多种算法的程序 可用于比较不同的序列。在这种情况下中，Needleman和Wunsch算法或Smith和Waterman 算法产生特别可靠的结果。为实施序列比对，可以使用程序PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5,151)或程序 Gap 和 BestFit(Needleman 1970, J Mol Biol 48 ;443;Smith 1981，Adv Appl Math 2, 482)，所述程序是GCG软件包（Genetics Computer Group 1991,575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)的部分。在本发明的另一个方面，使用程序GAP,在 整个序列区域范围内采用以下设置确定上文以百分数（％)提及的序列同一性值：空位权 重：50,长度权重：3,平均匹配：10. 000和平均错配：0. 000,除非另外说明，否则应当总是使 用所述设置作为序列比对的标准设置。
[0017] 还优选地，通过在来自受试者的样品中检出至少一种病毒多核苷酸、优选地病毒 DNA，检测HBV的存在。病毒多核苷酸或整个HBV基因组的核苷酸序列是本领域熟知的。优 选地，HBV核苷酸序列以GenBank登录号NC_003977. 1保藏。技术人员理解，将HBV多核苷 酸作为生物标记提及，不作为具体多核苷酸提及，并且术语HBV涵盖包含变异核苷酸序列 的各种HBV毒株。因此，具有以GenBank登录号保藏的具体序列的前述多核苷酸应理解为 代表生物标记的示例性序列。根据本发明还涵盖变体多核苷酸，所述变体多核苷酸因至少 一个核苷酸添加、置换和/或缺失而不同于具有具体序列的变体多核苷酸，只要它们也合 适作为如上文讨论的HBV感染的生物标记。优选地，变体多核苷酸与具体多核苷酸同一至 少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %。同 一性可以如本文中他处对氨基酸序列所述那样计算。
[0018] 优选地，本文中提及的HBV感染是慢性HBV感染，其中所述慢性HBV感染优选地以 HBV在受试者中可检测地存在多于4周、多于5周、多于6周、多于7周、多于8周、多于9周、 多于10周、多于11周或多于12周为特征。更优选地，本文中提及的慢性HBV感染符合疾 病控制中心（CDC)公开的定义，根据所述定义，慢性HBV感染以如下实验室标准为特征：乙 型肝炎核心抗原的IgM抗体（IgM抗HBc)阴性並I以下检验之一为阳性结果：乙型肝炎表 面抗原（HBsAg)、乙型肝炎e抗原（HBeAg)或乙型肝炎病毒(HBV) DNA,或者间隔至少6个月 HBsAg阳性或HBV DNA阳性2次（间隔6个月进行的这些检验的任何组合都是可接受的）。
[0019] 术语"干扰素治疗"和"标准治疗"优选地指用干扰素和优选地病毒DNA聚合酶 抑制剂治疗HBV感染。然而，本发明还构思干扰素治疗优选地是用干扰素单一治疗并且标 准治疗优选地是用病毒DNA聚合酶抑制剂单一治疗。优选地，如这个情境下提到的干扰素 是与聚乙二醇共价结合的干扰素（PEG-干扰素），更优选地，干扰素是干扰素2 α，最优选 地，干扰素是与聚乙二醇共价结合的干扰素 2 a (peg-干扰素 2 α，市售为PEGasys?J。 优选地，病毒DNA聚合酶抑制剂是核苷酸或核苷类似物，更优选地是{[2- (6-氨基-9H-嘌 呤-9-基）乙氧基]甲基}膦酸（例如adefovir?:)。因而，标准或干扰素治疗优选 地是用干扰素2 α和核苷酸类似物治疗。更优选地，标准或干扰素治疗是用PEG-干扰素 2α和核苷酸类似物治疗，并且甚至更优选地标准干扰素治疗是用PEG-干扰素2α (例如 PEGasys?:)和adefovir?:治疗持续少于1年。最优选地，标准干扰素治疗是根据以 下治疗计划用peg-干扰素2α (例如PEGasys?,)和adefovir?_治疗：通常，通过皮下 施用（每周皮下注射）实施PEGasys⑧治疗持续48周时间，而将病毒dna聚合酶抑制剂 (核苷/核苷酸类似物）经口服施用更长时间，即在80%患者中持续超过1年。关于详细 内容，还见 J.L.Dienstag N Engl J Med 2008,359;1486-1500。
[0020] 术语"对干扰素治疗敏感"意指与成功治疗的机率相比，可以成功地治疗受试者或 可以至少以显著增加的可能性成功地治疗受试者。可以通过如本文提到的干扰素治疗成功 治疗的受试者也称作反应个体。如果将HBV感染、与之相关的至少一种症状或与之相伴的 至少一种并发症改善到显著程度和/或治愈，则如本文提到的治疗是成功的。优选地，成功 的治疗还伴随在如本文以上所述来自受试者的样品中可检测的HBV多肽和/或HBV多核苷 酸减少。更优选地，成功的治疗特征如下：在治疗最多1年、最多50周、最多49周或最多 48周后来自受试者的样品中不存在可检测量的HBsAG和/或HBeAG，如治疗启动后60至80 周、优选地65至75周，或最优选地72周所测定。
[0021] 不能通过干扰素治疗成功治疗的受试者也称作非反应个体。在这类受试者中，不 出现HBV感染、与之相关的至少一种症状或至少一个并发症的改善或治愈。优选地，这种 非反应个体受试者患有严重形式的慢性肝炎B病毒感染，其中在干扰素治疗之前和之后可 检出HBsAG，但是不可检出HBeAG，或其中在标准干扰素治疗之前和之后可检出HBsAG和 HBeAG。应当考虑被鉴定为对干扰素治疗不敏感的受试者施用改良治疗措施,例如增加干扰 素和/或聚合酶抑制剂的剂量和/或延长治疗和/或额外用药。
[0022] 如本文所用，术语"HBV免疫复合物"指在至少一种HBV多肽和如下文所述的针对 所述至少一种HBV多肽的至少一种免疫球蛋白（即抗HBV免疫球蛋白）之间形成的复合 物。优选地，该复合物在至少一种HBV多肽和多于1种，多于2种、多于3种、多于4种、多 于5种、多于10种、多于20种、多于50种或多于100种针对所述至少一种HBV多肽的抗 HBV免疫球蛋白分子之间形成。优选地，HBV多肽选自与上文相关的一系列HBV抗原，更优 选地，HBV多肽是HBsAg。抗HBV免疫球蛋白优选地是在受试者的至少一种体液、优选地血 液或血清中存在的可溶性免疫球蛋白。优选地，抗HBV免疫球蛋白是IgG，更优选地是血清 IgG。最优选地，包含于HBV免疫复合物中的抗HBV免疫球蛋白是针对HBsAg的IgG，即抗 HBsAG IgG。应当理解HBV免疫复合物可以包含在本说明书中明确详述之外的其他分子，然 而，优选本发明的抗HBV免疫球蛋白和HBV多肽形成主要部分的HBV免疫复合物。因此，抗 HBV免疫球蛋白和HBV多肽优选地构成HBV免疫复合物质量的至少25%、至少30%、至少 40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少75%。更优选地，HBV免疫复合物基本上由抗 HBV免疫球蛋白和HBV多肽组成，即抗HBV免疫球蛋白和HBV多肽构成HBV免疫复合物质量 的至少80%、至少90%或至少95%。甚至更优选地，HBsAg和抗HBsAG IgG构成主要部分 的HBV免疫复合物。最优选地，HBV免疫复合物基本上由HBsAg和抗HBsAG IgG组成。
[0023] 技术人员理解术语"免疫球蛋白"或"Ig"。它们指免疫球蛋白家族的成员分子，特 征在于它们是由响应于与外来抗原接触的个体的免疫系统产生的可溶性多肽。优选地，免 疫球蛋白是来自哺乳动物的免疫球蛋白，并且更优选地，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。还优 选地，免疫球蛋白选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。更优选地，免疫球蛋白是IgG，最优选地 是人IgG。人IgG以大约150kDa的分子质量和由两条约50kDa的相同重链和两条约25kDa 的相同轻链组成的结构为特征。这两条重链经由二硫键彼此连接并与轻链连接以形成常见 的Y形分子。优选地，IgG是糖基化的，更优选地IgG通过N-糖基化过程糖基化。优选地， IgG 属于亚组 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 之一。
[0024] 术语"抗免疫球蛋白抗体"优选地涉及来自抗体的蛋白家族中的可溶性分子，所述 抗体识别免疫球蛋白，优选地识别人免疫球蛋白，即本发明的抗免疫球蛋白抗体优选地是 抗人免疫球蛋白抗体，更优选地识别人IgG，即抗人IgG抗体。本发明的抗免疫球蛋白抗体 优选地是具有低到中等亲和力（affinity)的抗体和具有高亲合力（avidity)的抗体，如下 文详述。抗体对表位的亲和力定义为在所述抗体上的抗原识别位点和该表位之间全部非共 价相互作用的强度。具有高亲和力的抗体通过许多和/或强烈非共价相互作用与抗原牢固 结合，并且因此保持与抗原结合持续相对长的时间段。在另一方面，具有低亲和力的抗体 抗体以少和/或弱的非共价相互作用与抗原进行相互作用，并且因此与抗原快速解离。本 领域技术人员已知的抗体的亲和力可以由它的解离常数（K d)描述。优选地，Kr1(lm〇l/l至 l(T9m〇l/l的解离常数表示极高亲和力，ΙΟΛιοΙ/Ι的解离常数表示高亲和力，l(T 7m〇l/l的 解离常数表示低亲和力，并且l〇_6mol/l及更高的解离常数表示很低的亲和力。因而，抗免 疫球蛋白抗体的解离常数优选地是l〇_ 6mol/l至l(T8m〇l/l，更优选地，解离常数是ΚΓ7至 ΙΟΛιοΙ/Ι。在包含多于一个结合位点的分子（例如抗体）中，第一结合位点的相互作用增 加其他结合位点相互作用的概率。技术人员将包含多于一个结合位点的分子和待结合的分 子之间这类多重相互作用的强度称作亲合力。高亲合力因此可以补偿单个结合位点的相对 低的亲和力。因而，抗免疫球蛋白抗体，优选地，具有多于2个抗原识别位点，更优选地多于 4个抗原识别位点。最优选地，抗免疫球蛋白抗体具有10个或更多个抗原识别位点。优选 地，抗免疫球蛋白抗体是IgG、IgD、IgE，更优选地抗免疫球蛋白抗体是包含多于2个抗原识 别位点的抗体，例如IgA，最优选地，抗免疫球蛋白抗体是在一个分子中包含多于4个抗原 识别位点的抗体，例如IgM。抗免疫球蛋白抗体是多克隆或单克隆的，并且在在适用于抗体 生产的哺乳动物中或哺乳动物细胞中产生。优选地，抗免疫球蛋白抗体与本发明免疫球蛋 白的表位特异性结合。更优选地，抗免疫球蛋白抗体是抗人免疫球蛋白抗体，即与本发明的 人免疫球蛋白结合，甚至更优选地，该结合是对人免疫球蛋白特异的。最优选地，抗免疫球 蛋白抗体是抗人IgG抗体，即与人IgG特异性结合。然而，本发明还构思，抗免疫球蛋白抗体 与由免疫球蛋白与HBV免疫复合物中的HBV多肽结合所形成的新表位（neoepitope)特异 性结合。怎样产生抗体的方法是本领域熟知的并且例如包括，根据已知的方案免疫活动物 或在细胞培养系统中产生单克隆抗体或多克隆抗体（Sambrook等人，1989,1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual)。优选地，抗免疫球蛋白抗体在小鼠、大鼠、兔、猪、牛、驴、 山羊、绵羊等中或在卵中产生。然而，本发明还考虑在转基因植物中产生抗免疫球蛋白抗 体。优选地，抗免疫球蛋白抗体是IgM，最优选地是单克隆IgM。更优选地，抗免疫球蛋白 抗体是抗（聚集的人IgG) IgM，即对人IgG具有如本文以上所述的低亲和力和高亲合力 的IgM，例如，如WO 2008/135274中所述<h-agg. IgG>IgM，最优选地，抗人免疫球蛋白抗 体是 MAb〈h-Agg. -IgG>M-3. 022. 5-IgM(DSM ACC2873)、MAb〈h-Agg. -IgG>M-l. 010. 2-IgM 和 MAb〈h-Agg. -IgG>M-l. 1. 7-IgM(表 1 中显示），MAb〈h-Agg. -IgG>M-3. 022. 5-IgM(DSM ACC2873)是最优选的。
[0025] 优选地，抗免疫球蛋白抗体携带标签。如本文所用的术语"标签"指能够产生可检 测信号的任何物质。优选地，标签是色原体、荧光、化学发光或电化学发光化合物、催化剂、 酶、酶底物、染料、胶态金属或非金属粒子或有机聚合物颗粒等。
[0026] 如本文所用，术语"受试者"指哺乳动物，并且优选地指人。受试者优选地患有HBV 感染。更优选地，受试者患有慢性HBV感染。另外，受试者优选地具有未知的HBV e抗原状 态。
[0027] 术语"样品"指体液样品，指来自组织或器官的样品，或指从外体表或内体表获得 的洗液/淋洗（wash/rinse)液样品。样品优选地包含多肽，更优选地是HBV抗原，最优选 地是HBsAg。本发明的方法涵盖血、血浆、血清、尿、唾液或泪液的样品。这类样品可以通过 使用刷、（棉）药签、刮铲（spatula)、淋洗液/洗液、钻取活组织检查装置、用针和外科器械 穿刺腔体（cavity)获得。然而，作为本发明的样品，还包括通过熟知技术获得的样品，所述 样品优选地包括来自泌尿生殖道、肛周区、肛管、口腔、上呼吸消化道和表皮的刮擦、药签或 活组织检查样品。无细胞流体可以通过分离技术如过滤或离心从体液或组织或器官获得。 优选地，样品从已知在被HBV感染的受试者中包含HBV多肽的体液（S卩，优选地，血、血清、 唾液等）获得。应当理解可以进一步加工样品以实施本发明的方法。特别地，可能通过本 领域已知的方法和工具从获得的样品移除细胞。另外，可通过本领域已知的方法和工具从 获得的样品提取和/或纯化HBV免疫复合物。因而，术语样品还可以指从如上文提到的任 何样品纯化和/或提取的HBV免疫复合物。
[0028] 术语"确定"指对样品中存在的HBV免疫复合物的量定量，即测量所述HBV免疫复 合物的量或浓度，优选地半定量或定量地测量。可以直接或间接地进行测量。确定免疫复 合物的量可以按照技术人员已知的多种方式，例如凝胶过滤层析，随后蛋白质印迹法、免疫 共沉淀法等完成。优选地，通过在下文实施例中描述的方法确定HBV免疫复合物的量。有 利地，发现在实施例中使用的夹心-ELISA允许可靠地对HBV免疫复合物定量。另外，发现 使用聚集的抗体，例如聚集的IgG，作为抗人Ig抗体，导致高度改善的信噪比。
[0029] 根据本发明，可以通过用于确定样品中多肽或肽的量的全部已知手段实现确定 HBV免疫复合物的量，只要其适用于特异性检测本发明的HBV免疫复合物。优选地，将使用 与HBV免疫复合物特异性结合、从而可对其进行检测的检测剂。检测剂优选地涵盖与所述 复合物特异性结合的抗体或其片段、与所述复合物特异性结合的适配体（aptamer)、抗运载 蛋白（Anticalin)或设计的锚蛋白重复序列蛋白（DARPin)。优选地，适用双特异性免疫测 定法，即如下测定法，其中信号的存在或强度将取决于包含于HBV免疫复合物中的两种分 子（即HBV多肽和抗HBV免疫球蛋白）的存在。所述工具包括可以按各种夹心、竞争或其他 分析模式利用标记分子的免疫测定法装置和方法。所述测定法将形成指示HBV免疫复合物 存在或不存在的信号。另外，信号强度可以优选地直接或间接地相关于（例如反比于）样品 中存在的HBV免疫复合物的量。所述方法优选地包括生物传感器、与免疫测定法偶联的光 学装置、生物芯片、分析装置如质谱仪、NMR分析仪或色谱装置。另外，方法包括基于微量平 板ELISA的方法、全自动化或机器人免疫测定法（例如在多参数生物芯片平台或Elecsys? 分析仪上可用）、CBA (酶促钴结合测定法，例如在Roche-Hitachi?分析仪上可用）和乳胶 凝集测定法（例如在Roche-Hitachi?分析仪上可用）。
[0030] 如本文所用的术语"量"涵盖本文中提及的HBV免疫复合物的绝对量、本文中提及 的HBV免疫复合物的相对量或浓度，以及与之相关的任何值或参数。这些值或参数包括通 过测量从本文中提及的HBV免疫复合物获得的来自所有特定物理或化学特性的强度信号 值，例如，响应于本文中提及的多肽从生物读出系统确定的表达水平，或从特异性结合的配 体获得的强度信号。应当理解也可以通过所有标准数学操作获得与前述量或参数相关的 值。
[0031] 如本文所用的"比较"涵盖将待分析样品所包含的本文提及的HBV免疫复合物的 量与本说明书中他处所述的合适参比样品中的所述HBV免疫复合物的量比较。还涵盖将样 品中HBV免疫复合物的量与HBV抗原、优选地HBsAg的量的比率与合适的参考比率比较。应 当理解如本文所用的比较，指比较相应的参数或值，例如，将如本文提到的HBV免疫复合物 绝对量与所述HBV免疫复合物的绝对参比量比较；将如本文提到的HBV免疫复合物的浓度 与所述HBV免疫复合物的参比浓度比较；将测试样品中从如本文提到的HBV免疫复合物获 得的强度信号与参比样品中所述HBV免疫复合物的相同类型的强度信号比较；或将HBV免 疫复合物的量对如本文提到的HBV抗原的量的比率与相应的参考比率比较。在本发明的方 法中提及的比较可以人工地或在计算机辅助下实施。对于计算机辅助比较，测定的量或比 率的值可以与对应于由计算机程序在数据库中存储的合适参比的值比较。该计算机程序还 可以借助专家系统评价该比较的结果。因此，本文中提及的鉴定的结果可以按合适的输出 格式自动提供。
[0032] 如本文所用，术语"参考值"指HBV免疫复合物的量，所述量允许评估样品所来源 的受试者应对干扰素治疗敏感或对干扰素治疗不敏感。合适的参考值可以从待分析的参比 样品连同样品一起（即同时或相继）确定。
[0033] 原则上，可以基于给定的HBV免疫复合物的平均值或均值（average or mean)，通 过采用标准统计学方法，对如本文所述的受试者组或群组计算参考量。具体而言，一种检验 法验如旨在诊断某事件存在与否的方法的准确度由其接受者操作特征（R0C)最佳描述（特 别见Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577)。R0C曲线是因在观察到的整个数据范围内连续 变动决策阈值所产生的全部灵敏度与特异性成对值的曲线。诊断方法的临床表现取决于 其准确度，即其将受试者正确划至某种预后或诊断的能力。通过在适于进行区分的完整阈 值区间将灵敏度对1-特异性作图，R0C曲线指示两种分布之间的重叠。在y-轴上是灵敏 度或真阳性部分，其定义为真阳性试验结果数对真阳性数和假阴性试验结果数的乘积的比 率。在疾病或病症存在的情况下，这又称作阳性（positivity)。它完全从患病的亚组计算。 在X-轴上是假阳性部分或1-特异性，其定义为假阳性试结果数对真阴性数和假阳性结果 数的乘积的比率。它是特异性的指标并且完全从未患病的亚组计算。因为完全通过使用来 自两个不同亚组的试验结果分别计算真阳性分数和假阳性分数，所以R0C曲线与群组中事 件的患病率无关。R0C曲线上的每个点表示与特定决策阈值相对应的灵敏度/-特异性配对 物。完美区分（结果的两个分布中无重叠）的检验具有穿过左上角的R0C曲线，其中真阳 性分数是1.0或100% (完美灵敏度），假阳性分数是〇(完美特异性）。无区分（两个组的 结果的相同分布）的检验的理论曲线是从左下角至右上角的45°对角线。大部分曲线落 在这两种极端情况之间。如果ROC曲线完全落在45°对角线以下，则通过将"阳性"标准从 "大于"逆转至"小于"或相反操作容易地纠正这种情况。定性地，曲线越靠近左上角，则检 验的总准确度越高。取决于所需的置信区间，可以从ROC曲线导出阈值，所述阈值允许以灵 敏度和特异性的适宜平衡分别诊断或预测给定事件。因此，可以优选地通过如上文所述那 样建立所述群组的ROC并从中导出阈值量，产生针对本发明方法所用的参考。取决于诊断 方法的所需灵敏度和特异性，ROC曲线允许导出合适的阈值。
[0034] 优选地，如本文所用的参考量从治疗之前的受试者样品获得，但是对所述样品，已 知它们的供体是否响应治疗。该参考量水平可以是离散的数值或可以是数值范围。显然，参 考水平或量可以在HBV免疫复合物的个体种类之间变动。因此，测量系统优选地用一份样 品或用一系列样品校准，所述样品包含已知量的HBV免疫复合物或多种HBV免疫复合物。更 优选地，该系统用一系列混合物校准，所述混合物包含限定体积的仅含HBsAg的血清，即， 包含大量的HBsAg但不含抗HBV免疫球蛋白或HBV免疫复合物的血清，和仅含抗HBsAg免疫 球蛋白的血清，例如，包含高滴度抗HBsAG IgG但不包含HBsAg或HBV免疫复合物的血清。 技术人员理解在这种情况下HBV免疫复合物的量将优选地表述为任意单位（AU)。因此，优 选地通过将从样品获得的信号与包含于校正曲线中的信号比较，确定HBV免疫复合物或多 种HBV免疫复合物的量。
[0035] 适用于个体受试者的参考量可以根据各种生理学参数如年龄、性别或亚群变动。 因此，合适的参考值可以通过本发明的方法，从待分析的参考样品连同测试样品一起（即 同时或相继）确定。另外，可以优选地使用阈值量作为参考量。优选地，高于阈值量的HBV 免疫复合物的量表示轻度的HBV感染；并且等于或低于阈值量的HBV免疫复合物的量表示 重度的HBV感染。应当理解前述的量可以因统计学和测量误差变动。
[0036] 在本发明方法的一个实施方案中，已经发现增加的HBV免疫复合物的量优选地表 示受试者对干扰素治疗敏感，而减少的HBV免疫复合物的量表示受试者对干扰素治疗不敏 感。在这种情况下，参考量优选地是这些量，所述量是在治疗给定受试者群体或群组之前存 在于患有HBV的受试者中的平均量或均数量（average or mean amount)。本文中提及的 HBV免疫复合物量的减少或增加优选地是统计显著的减少或增加。
[0037] 参考量可以优选地从已知对干扰素治疗敏感的患有HBV的受试者或受试者组的 样品导出。在这种情况下，确定与该参考量相比实质上相同或增加的HBV免疫复合物的量 应当表示受试者对干扰素治疗敏感。减少的量应当表示对干扰素治疗不敏感的受试者。
[0038] 参考量还可以优选地从已知对干扰素治疗不敏感的患有HBV的受试者或受试者 组的样品导出。在这种情况下，确定与该参考量相比实质上相同或减少的HBV免疫复合物 的量应当表示受试者对干扰素治疗不敏感。增加的量应当表示对干扰素治疗敏感的受试 者。
[0039] 有利地，发现确定来自受试者的样品中HBV免疫复合物的量允许鉴定将患有乙型 肝炎病毒（HBV)感染的受试者鉴定为对标准干扰素治疗敏感。如本文在实施例中详述的， 优选地，增加的HBV免疫复合物的量表示受试者对干扰素治疗敏感，而减少的HBV免疫复合 物的量表示受试者对干扰素治疗不敏感。优选地，这意味具有大量HBV免疫复合物的受试 者具有响应于标准干扰素治疗的高概率，并且意味具有少量HBV免疫复合物的受试者具有 响应于标准干扰素治疗的低概率。因此可以在疗法启动之前使用本发明的方法决定受试者 是否应当用标准干扰素疗法治疗或该受试者是否应当优选地接受改良疗法。还有利地，发 现知晓受试者的HBeAg状态并且因此确定其HBeAg状态与本发明的用于正确地鉴定对干扰 素治疗敏感的受试者的方法无关。
[0040] 上文作出的定义在已作必要修正时适用于以下情况：
[0041] 本发明还构思一种通过干扰素疗法治疗患有HBV感染的受试者的方法，所述方法 包括将受试者鉴定为对干扰素治疗敏感，优选地，通过本发明的前述方法鉴定，并且向被鉴 定为干扰素治疗对敏感的受试者施用治疗有效量的如本文中他处所述的干扰素治疗。
[0042] 本发明还涉及一种用于在患有HBV感染的受试者中区分轻度HBV感染和重度HBV 感染的方法，所述方法包括步骤：
[0043] a)确定所述受试者的样品中HBV免疫复合物的量，
[0044] b)将步骤a)中获得的HBV免疫复合物的量与参考值比较；并且
[0045] c)基于步骤b)中比较的结果区分轻度HBV感染和严重HBV感染。
[0046] 在这种情况下，重度的HBV感染以如本文中他处所述的减少的HBV免疫复合物的 量为特征，而轻度的HBV感染以增加的HBV免疫复合物的量为特征。在这种情况下，参考量 优选地是这些量，所述量是在治疗给定受试者群体或群组之前存在于患有HBV的受试者中 的平均量或均数量。
[0047] "轻度的HBV感染"优选地是一种可以通过如本文中他处所述的干扰素疗法治疗的 形式，而"重度"优选地是不能通过干扰素疗法治疗的慢性HBV感染。
[0048] 本发明也涉及来自患有HBV感染的受试者的样品中HBV免疫复合物的量或用于这 种样品中HBV免疫复合物的检测剂用于将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感 的用途。
[0049] 本文中他处详细描述了可以用于确定样品中存在的HBV复合物的合适检测剂。
[0050] 另外，本发明还涉及一种用于将患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的受试者鉴定为对 干扰素治疗敏感的装置，包括用于确定HBV免疫复合物的量的分析单元，和用于将所述量 与参考量比较以及用于将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的评价装置。
[0051] 如本文所用的术语"装置"指一种工具系统，所述系统至少包括彼此有效关联以允 许区分的前述工具。上文与本发明方法相关地公开了用于确定所述HBV免疫复合物的量 的优选工具和用于实施比较的工具。怎样以运行方式连接工具将取决于纳入装置中的工具 的类型。例如，在使用自动确定HBV免疫复合物的量的工具情况下，由所述自动运行工具获 得的数据可以由例如计算机程序处理，以建立诊断（即鉴定对敏感干扰素治疗的受试者）。 在这种情况下，优选地，所述工具包含在单一装置中。所述装置可以因此包括用于测量样品 中HBV免疫复合物的量的分析单元和用于处理所得数据以便诊断的评价装置。备选地，在 工具如测试条（test stripe)用于确定HBV免疫复合物的量情况下，用于诊断的工具可以 包括对照条或对照表，所述对照纸条或对照表将测定的量划至已知伴随响应于标准干扰素 治疗或伴随不响应于干扰素治疗的量。用于检测的优选工具与涉及本发明以上方法的实施 方案相联系地公开。在这种情况下，工具是有效关联的，在于该系统的用户由手册中给出的 说明和阐释将确定该量的结果和其诊断值联系到一起。该工具在这种实施方案中可以作为 独立的装置出现并且优选地包装在一起作为试剂盒。本领域技术人员将无需进行其他创造 性工作即可了解如何关联该工具。优选的设备是可以在不具备专业临床医生的特定知识的 情况下应用的那些，例如，仅需要加载样品的测试条或电子装置。结果可以作为参量诊断原 始数据的输出，优选地，作为绝对量或相对量给出。应当理解这些数据将需要由临床医生解 释。但是，还构思了专家系统装置，其中输出包含不需要专业临床医生解释的处理过的诊断 原始数据。其他优选的装置包括上文根据本发明方法所提及的分析单元/装置（例如，生 物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体连接的固相支持物、等离子体表面共振装置、NMR 波谱仪、质谱仪等）或评价单元/装置。
[0052] 本发明构思一种试剂盒，其包含实施本发明方法的说明书、用于确定HBV免疫复 合物的量的检测剂，和优选地允许将患有HBV感染的受试者鉴定为对标准干扰素治疗敏感 的参考量的标准。
[0053] 如本文所用，术语"试剂盒"指前述组分的综合，所述组分优选地分别或在单一容 器内部提供。该容器还优选地包括用于实施本发明方法的说明书。已经在本说明书中给出 试剂盒的这类组分的例子以及它们的使用方法。试剂盒优选地含有即用型制剂形式的前述 组分。优选地，试剂盒可以额外地包括说明书，例如，相对于本发明方法提供的诊断，解读任 何测定结果的用户手册。特别地，这类手册可以包括将所确定HBV免疫复合物的量划分至 诊断类型的信息。在本说明书中他处将找到详细内容。另外，这类用户手册可以提供关于 正确使用试剂盒组分以确定相应生物标记的量的说明。用户手册可以按纸质形式或电子形 式提供，例如存储在CD或CDR0M上。本发明还涉及所述试剂盒在本发明的任何方法中的用 途。
[0054] 将本说明书中援引的全部参考文献在此就其完整公开内容和本说明书中具体提 到的公开内容而言均通过引用的方式并入。
[0055] 附图
[0056] 图1 :HBV免疫复合物检测原理；抗HBsAg捕获抗体（生物素aHBSl，生物素aHBS2) 与固体表面结合。将HBV免疫复合物（包含HBsAg和抗HBsAG IgG)捕获至该表面并用单 克隆IgM检测，所述单克隆IgM具有低亲和力，但对与地高辛配基（Digoxigenin)缀合的人 IgG具有高亲合力（抗〈聚集的人IgG>IgM-地高辛配基）。
[0057] 图2:研究设计的示意图。
[0058] 图3 :HBV免疫复合物的量与不根据HBeAg状态区分的群组中针对标准治疗的反 应;A)和B):在第0周（即在启动治疗之前，A)和在治疗第12周⑶HBsAg在来自响应于 (R)或不响应于（NR)标准治疗的患者的血清样品中的浓度。反应个体和非反应个体之间的 差异不是统计显著的。C)和D) :在第0周（C)和在治疗第12周（D) HBsAg/抗HBsAG IgG 复合物在来自响应于（R)或不响应于（NR)标准治疗的患者的血清样品中的浓度。在第0 周（p = 0. 0093)和在第12周（P = 0. 0179)，反应个体和非反应个体之间的差异是统计显 著的。
[0059] 图4 :图3中获得的数据的R0C曲线。 实施例
[0060] 以下实施例应当仅说明本发明。它们应当不被解释为限制本发明的范围。
[0061] 实施例1
[0062] 产生具有类风湿性因子样特异性的单克隆小鼠 IgM抗体
[0063] 免疫原：H_IgG聚合物：
[0064] 将10mg人IgGl (Sigma公司）溶解于0· 6ml 25mM碳酸氢盐缓冲液pH 9. 5中。在添 加3. 5μ 1 12. 5%戊二醛溶液后，将它在室温温育2小时。随后，将它在冰浴中冷却，用50mM 三乙醇胺溶液pH 8. 0调节至pH 8. 3并且添加0. 15ml新鲜制备的硼氢化钠溶液（8mg硼氢 化物/ml水）。在0°C 2. 5小时后，将制备物在4°C针对10mM磷酸钾缓冲液/0. 2M NaCl， pH 7. 5透析16小时。将含有IgG聚合物的透析液以等分试样贮存在80°C或用于免疫和用 于杂交瘤细胞的培养上清液中的特异性检验。从人IgG3 (Sigma Company)开始，以相似方 式产生H-IgG3聚合物。
[0065] 小鼠的免疫：
[0066] 将12周龄雌性BALB/c小鼠用100 μ g Η-IgGl或IgG3聚合物连同佐剂CFA(弗氏 完全佐剂）一起腹膜内首次免疫。在8日后，用CFA中100 μ g相应的IgG聚合物实施进一 步免疫。在初始免疫后13日，在没有佐剂的情况下腹膜内施用200 μ g相应的聚合物，在初 始免疫后14日和15日，在每种情况下腹膜内和静脉内施用100 μ g。在16日后实施融合。 [0067] 杂交瘤克隆的产生：
[0068] 融合和克隆：
[0069] 遵循 Galfr6, G. , Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46 中的方法，使免疫小 鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。免疫小鼠的大约lxl〇8个脾细胞与2xl07个骨髓瘤细胞 (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580)混合并离心（以 300g 和 4°C持续 10 分钟）。
[0070] 随后将细胞用不含胎牛血清（FCS)的RPMI-1640培养基洗涤1次并在50ml锥形 管中以400g再次离心。添加 lml PEG(聚乙二醇）（分子量4000, MERCK, Darmstadt)并通 过抽吸混合。在37°C于水浴中1分钟后，逐滴添加不含FCS的5ml RPMI 1640,混合，用培养 基（RPMI1640+10% FCS)补充直至50ml并随后离心。使沉降的细胞悬于含有10% FCS的 RPMI 1640培养基中并且接种在次黄嘌呤-偶氮丝氨酸选择培养基中（RPMI1640+10% FCS 中的100mmol/l次黄噪呤，1 μ g/ml偶氮丝氨酸）。添加白介素6(100U/mL)至培养基作为 生长因子。在约10日后，对原代培养物测试特异性抗体合成。在96孔细胞培养平板中借 助荧光激活的细胞分选仪克隆了显示与聚集的人IgGl的阳性反应，但与单体IgG无交叉反 应的原代培养物。添加白介素6 (100U/mL)至培养基作为生长添加物。
[0071] 以这种方式获得以下杂交瘤克隆：
[0072] 表 1 :
[0073]
【权利要求】
1. 一种用于将患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的方 法，所述方法包括步骤： a) 确定所述受试者的样品中HBV免疫复合物的量， b) 将步骤a)中获得的HBV免疫复合物的量与参考量比较，并且 c) 基于步骤b)中比较的结果，将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感， 其中受试者的HBV e抗原状态是未知的。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述HBV感染是慢性HBV感染。
3. 根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中干扰素治疗包括用PEG-干扰素和病 毒DNA聚合酶抑制剂治疗。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述tog-干扰素治疗是PEGasys?和所述病毒 dna聚合酶抑制剂是Adefovir?。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中HBV免疫复合物包含乙型肝炎可溶 性抗原（HBsAg)和抗 HBsAG IgG。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中增加的HBV免疫复合物的量表示受 试者对干扰素治疗敏感，减少的HBV免疫复合物的量表示受试者对干扰素治疗不敏感。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中样品是血清样品。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中用抗免疫球蛋白抗体检测HBV免疫 复合物的量。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中i)HBV免疫复合物包含抗HBsAG IgG、抗HBeAg IgG或抗HBcAg IgG，其中ii)用抗（聚集的人IgG)IgM检测HBV免疫复合物 的量。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中用酶联免疫吸附测定法（ELISA)确 定HBV免疫复合物的量。
11. 来自患有HBV感染的受试者的样品中HBV免疫复合物的量或用于这种样品中的 HBV免疫复合物的检测剂用于将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的用途。
12. -种用于将患有乙型肝炎病毒（HBV)感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的装 置，包括用于确定HBV免疫复合物的量的分析单元，和用于将所述量与参考量比较以及用 于将患有HBV感染的受试者鉴定为对干扰素治疗敏感的评价装置。
13. -种试剂盒，其包含实施本发明方法的说明书、用于确定HBV免疫复合物的量的检 测剂，和优选地允许将患有HBV感染的受试者鉴定为对标准干扰素治疗敏感的参考量的标 准。
14. 根据权利要求11所述的用途，根据权利要求12所述的装置，或根据权利要求13所 述的试剂盒，其中受试者的HBV e抗原状态是未知的。
【文档编号】G01N33/68GK104126124SQ201380010278
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年2月18日 优先权日:2012年2月20日
【发明者】U·克劳斯, B·希普, V·P·格鲁纳特, B·乌普迈尔, U·洛帕汀, A·德涅特, H·里辛克, H·扎伊捷尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司, 阿姆斯特丹大学学术医学中心