一种检测孔雀石绿的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测孔雀石绿（MG）的核酸适配体电化学生物传感器。该电化学生物传感器利用电极表面修饰技术，将制备的石墨烯-壳聚糖复合物和纳米金修饰到电极表面，再通过化学作用将核酸适配体接在纳米金上，通过适配体与目标物的特异性结合作用将目标物结合到电极表面?，然后在接上目标物的抗体，构成夹心结构的生物传感器。当检测的溶液中含有目标物时，就能在电极表面固定一定量的目标物和相应的抗体，构成传感结构。由于抗体上修饰了辣根过氧化物酶（HRP），能催化过氧化氢的分解，从而产生电化学信号的变化，利用电化学信号的变化即可实现对孔雀石绿（MG）的检测。本发明制备的核酸适配体电化学生物传感器选择性强，灵敏度高，操作简单快速，适合水产品中孔雀石绿（MG）的检测。
【专利说明】—种检测孔雀石绿的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米材料和食品中有毒有害物质的检测领域，提供了一种检测孔雀石绿的电化学生物传感器，可以用于渔业生产中孔雀石绿的检测。
【背景技术】
[0002]孔雀石绿(Malachite Green，MG)化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，又名碱性绿、孔雀绿或者中国绿，属三苯甲烷类染料，孔雀石绿在水生动物体内会很快代谢成无色孔雀石绿。孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿成为重大的食品安全隐患。目前，孔雀石绿被我国被列为禁用渔药，因此，我们应当建立一种简单、快速、灵敏的检测孔雀石绿的方法。当前无色孔雀石绿的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)等。这些方法有操作繁琐、仪器价格昂贵，需要专业的技术人员，而且不适合现场大规模的检测等缺点。
[0003]本研究实现了一种利用核酸适配体电化学生物传感器检测鱼类食品中的孔雀石绿的方法，具有灵敏度高，分析速度快，操作简单以及成本低廉的特性。通过在玻碳电极表面修饰可以增强电化学信号的复合物，然后在修饰电极的表面绑定能与孔雀石绿特异性识别的适配体，构建了检测孔雀石绿的电化学生物传感器。由于适配体及抗体均是不导电的物质，被固定在电极表面之后会阻碍电子的传输，从而导致传感器电化学信号的变化，利用电化学信号的变化可以达到对待检测物进行检测的目的。
【发明内容】
[0004]本发明的内容之一是提供了一种检测食品中孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法。
[0005]本发明的内容之二是将所制备的核酸适配体电化学生物传感器用于检测鱼类食品中的孔雀石绿(MG)。
[0006]本发明的技术方案，包括以下步骤:
1、一种检测鱼类食品中孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
(I)石墨烯壳-聚糖复合物(GR-CS)的制备:
将0.02g的氧化石墨烯(GO)分散到20ml超纯水中，超声分散8h，加入0.5ml的PSS和足量的水合肼，90°C搅拌一天，将得到的黑色分散液用水冲洗η次后，干燥得到石墨烯(GR)。将制得的石墨烯溶于壳聚糖中，得到lmg/ml的石墨烯-壳聚糖复合物。
[0007](2)纳米金(AuNPs)的制备:
将100ml，0.01%的HAuCl4煮沸，然后将2ml，1%的柠檬酸钠快速添加到回流的HAuCl4溶液中，当颜色由淡黄变为深红时，及得到所要制备的纳米金。
[0008](3)核酸适配体溶液的配制: 用超纯水，0.1%的DEPC —起处理过夜，第二天灭菌去除DEPC来配置DEPC水溶液。然后将核酸适配体溶入到配置的DEPC溶液中，值得均一的溶液备用。
[0009](4)检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法，步骤如下: 取IOul的GR-CS均一溶液修饰在玻碳电极表面，室温过夜晾干；然后滴加IOul的
AuNPs，室温晾干；然后通过金氨键将核酸适配体固定在电极表面，室温晾干。
[0010]2、如上述制备的一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器，用于MG的检测步骤如下:
1)以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，核酸适配体电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，在铁氰化钾溶液中，扫描电位为0.5V，检测目标物质绑定前后的电信号变化孔雀石绿(MG)浓度的关系，绘制工作曲线；
2)将待测样品溶液代替孔雀石绿(MG)标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行检测。
[0011]上述制备的检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器，所用的原材料均在化学试剂公司购买。
[0012]本发明体现的优势和特点是:
(1)本发明采用的GR-CS-AuNPs复合物导电性强，成为构建电化学传感器的优良材
料；
(2)本发明制备的传感器灵敏度高，检测速度快，只需几分钟就可以完成一个基本的检测过程；
(3)本发明检测孔雀石绿(MG)的方法，操作简单、快速、灵敏，便于现场检测。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，还应理解，在阅读本发明所讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0014]实施例1
一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法，步骤如下:
(1)滴加IOul的GR-CS复合物均一溶液与玻碳工作电极表面，室温过夜晾干；
(2)滴加IOul的AuNPs在修饰的电极表面，室温晾干；
(3)用DEPC水溶液配置浓度为0.5mg/ml的核酸适配体溶液，并取IOul滴加在电极表
面，室温下晾干；
(4)以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，以(3)所得的电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，扫描电位为0.5V，采用即时电流法检测平衡时间时的电流。
[0015]实施例2
一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法，步骤如下:
(1)滴加IOul的GR-CS复合物均一溶液与玻碳工作电极表面，室温过夜晾干；
(2)滴加IOul的AuNPs在修饰的电极表面，室温晾干；
(3)用DEPC水溶液配置浓度为lmg/ml的核酸适配体溶液，并取IOul滴加在电极表面，
室温下晾干； (4)以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，以(3)所得的电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，扫描电位为0.5V，采用即时电流法检测平衡时间时的电流。
[0016]实施例3
一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法，步骤如下:
(1)滴加IOul的GR-CS复合物均一溶液与玻碳工作电极表面，室温过夜晾干；
(2)滴加IOul的AuNPs在修饰的电极表面，室温晾干；
(3)用DEPC水溶液配置浓度为2mg/ml的核酸适配体溶液，并取IOul滴加在电极表面，
室温下晾干；
(4 )以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，以(3 )所得的电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，扫描电位为0.5V，采用即时电流法检测平衡时间时的电流。
[0017]实施例4
一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法，步骤如下:
(1)滴加IOul的GR-CS复合物均一溶液与玻碳工作电极表面，室温过夜晾干；
(2)滴加IOul的AuNPs在修饰的电极表面，室温晾干；
(3)用DEPC水溶液配置浓度为5mg/ml的核酸适配体溶液，并取IOul滴加在电极表面，
室温下晾干；
(4 )以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，以(3 )所得的电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，扫描电位为0.5V，采用即时电流法检测平衡时间时的电流。
[0018]实施例5
将制备的一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体生物传感器用于孔雀石绿(MG)的检测，步骤如下:
(1)滴加IOul的GR-CS复合物均一溶液与玻碳工作电极表面，室温过夜晾干；
(2)滴加IOul的AuNPs在修饰的电极表面，室温晾干；
(3)用DEPC水溶液配置浓度为2mg/ml的核酸适配体溶液，并取IOul滴加在电极表面，
室温下晾干；
(4)将(3)所制备的电化学生物传感器在含有孔雀石绿(MG)的标准溶液中浸泡20min后，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，以所得的电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，在铁氰化钾溶液中，扫描电位为0.5V，检测目标物绑定前后电信号的变化与孔雀石绿(MG)浓度的关系，绘制孔雀石绿(MG)的工作曲线。
[0019]实施例6
将制备的一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体生物传感器用于孔雀石绿(MG)的检测，步骤如下:
(1)滴加IOul的GR-CS复合物均一溶液与玻碳工作电极表面，室温过夜晾干；
(2)滴加IOul的AuNPs在修饰的电极表面，室温晾干；
(3)用DEPC水溶液配置浓度为2mg/ml的核酸适配体溶液，并取IOul滴加在电极表面，
室温下晾干；
(4)将(3)所制备的电化学生物传感器在含有孔雀石绿(MG)的标准溶液中浸泡30min后，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，以所得的电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，在铁氰化钾溶液中，扫描电位为0.5V，检测目标物绑定前后电信号的变化与孔雀石绿(MG)浓度的关系，绘制孔雀石绿(MG)的工作曲线。
[0020]实施例6
将制备的一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体生物传感器用于实际样品中孔雀石绿(MG)的检测，步骤如下:
(1)滴加IOul的GR-CS复合物均一溶液与玻碳工作电极表面，室温过夜晾干；
(2)滴加IOul的AuNPs在修饰的电极表面，室温晾干；
(3)用DEPC水溶液配置浓度为2mg/ml的核酸适配体溶液，并取IOul滴加在电极表面，
室温下晾干；
(4)将(3)所制备的电化学生物传感器在含有孔雀石绿(MG)的标准溶液中浸泡30min后，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，以所得的电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，在铁氰化钾溶液中，扫描电位为0.5V，检测目标物绑定前后电信号的变化与孔雀石绿(MG)浓度的关系，绘制孔雀石绿(MG)的工作曲线。
[0021](5)将待测样品溶液代替孔雀石绿(MG)标准溶液，按照上述工作曲线的绘制方法进行检测。
[0022](6)采用制备的核酸适配体电化学生物传感器检测实际样品1，平行检测7次，样品I中未曾检测出孔雀石绿(MG)，属于合格样品；加标回收实验，其相对偏差为。
[0023]实施例6
将制备的一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体生物传感器用于实际样品中孔雀石绿(MG)的检测，步骤如下:
(1)滴加IOul的GR-CS复合物均一溶液与玻碳工作电极表面，室温过夜晾干；
(2)滴加IOul的AuNPs在修饰的电极表面，室温晾干；
(3)用DEPC水溶液配置浓度为2mg/ml的核酸适配体溶液，并取IOul滴加在电极表面，
室温下晾干；
(4)将(3)所制备的电化学生物传感器在含有孔雀石绿(MG)的标准溶液中浸泡30min后，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，以所得的电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，在铁氰化钾溶液中，扫描电位为0.5V，检测目标物绑定前后电信号的变化与孔雀石绿(MG)浓度的关系，绘制孔雀石绿(MG)的工作曲线。
[0024](5)将待测样品溶液代替孔雀石绿(MG)标准溶液，按照上述工作曲线的绘制方法进行检测。
[0025](6)采用制备的核酸适配体电化学生物传感器检测实际样品2，平行检测7次，样品2中未曾检测出孔雀石绿(MG)，属于合格样品；加标回收实验，其相对偏差为4.1% 。
【权利要求】
1.一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器，其特征在于，包括以下步骤: (1)石墨烯-壳聚糖复合物(GR-CS)的制备: 将0.02g的氧化石墨烯(GO)分散到20ml超纯水中，超声分散8h，加入0.5ml的PSS和足量的水合肼，90°C搅拌一天，将得到的黑色分散液用水冲洗η次后，干燥得到石墨烯(G，将制得的石墨烯溶于壳聚糖中，得到lmg/ml的石墨烯-壳聚糖复合物； (2)纳米金(AuNPs)的制备: 将100ml，0.01%的HAuCl4煮沸，然后将2ml，1%的柠檬酸钠快速添加到回流的HAuCl4溶液中，当颜色由淡黄变为深红时，及得到所要制备的纳米金； (3)核酸适配体溶液的配制: 用超纯水，0.1%的DEPC —起处理过夜，第二天灭菌去除DEPC来配置DEPC水溶液；然后将核酸适配体溶入到配置的DEPC溶液中，值得均一的溶液备用； (4)检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器的制备方法，步骤如下: 取IOul的GR-CS均一溶液修饰在玻碳电极表面，室温过夜晾干；然后滴加IOul的AuNPs,室温晾干；将核酸适配体固定在电极表面，室温晾干。
2.如权利要求1所述的制备一种检测孔雀石绿(MG)的核酸适配体电化学生物传感器，用于孔雀石绿(MG)的检测步骤如下: (1)以Ag/AgCl为参比电极，以Pt为对电极，核酸适配体电化学生物传感器为工作电极，连接到电化学工作站，在铁氰化钾溶液中，扫描电位为0.5V，检测目标物质绑定前后的电信号变化孔雀石绿(MG)浓度的关系，绘制工作曲线； (2)将待测样品溶液代替孔雀石绿(MG)标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行检测。
【文档编号】G01N27/26GK103713026SQ201410008020
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】王虹智, 黄加栋, 于京华, 刘素, 崔敏, 李 杰, 徐伟, 郭玉娜 申请人:济南大学