一种微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，包括下列步骤：(1)样品前处理；(2)富集和净化；（3）LC-MS/MS检测。本发明的方法操作简便、定性定量能力较强，可作为检测水质量和评估食品安全风险的可靠方法。
【专利说明】一种微囊藻毒素的液相色谱—串联质谱检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，属于仪器检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]藻类保健食品是一种主要由藻类单细胞植物粉为主要成分，加入少量赋形剂或单纯用藻粉为原料制成的保健食品。目前主要的食用藻类以螺旋藻为代表。螺旋藻含有丰富的蛋白质，矿物质(钙、铁、锌、磷、镁和碘等)，维生素(B1、B2、B12、C、E、K等)和β -胡萝卜素、Y -亚油酸、叶绿素以及各种对人体健康有用的氨基酸。
[0003]通过人工方法培养螺旋藻是目前生产藻类保健食品的主要方式，而可以产生毒素的铜绿微囊藻、绿色微囊藻、惠氏微囊藻、以及颤藻、鱼腥藻等和螺旋藻都属于蓝藻。从理论上讲，在严格的培养条件下可以控制产毒蓝藻的生长。但是由于目前国内螺旋藻生产企业的藻浆是在开放环境下培养、收获的，在生产过程中，养殖池水和螺旋藻浆都极有可能受到产毒蓝藻的污染，在收获螺旋藻浆液的同时收获了产毒蓝藻，由于对螺旋藻浆的洗脱不能完全去除产毒蓝藻，而由产毒蓝藻产生的微囊藻毒素就会污染藻类保健食品，从而对人类健康造成严重危害。
[0004]微囊藻毒素以肝脏为靶器官，能促使肿瘤细胞的生长，是迄今为止已发现的最强肝癌促进剂之一。我国部分地区的原发肝癌发病率高与当地居民长期接触微囊藻毒素有关。微囊藻毒素是一类环状七肽化合物，目前发现有大约60种异构体，在我国富营养化水体中常见的种类为MC-LR和MC-RR，其中MC-RR最常见，而MC-LR毒性最大。
[0005]目前关于微囊藻毒素的提取和检测方法也比较多，也有用液相色谱-串联质谱的方法检测，但之前的检测方法中，样品的前处理步骤毒素提取不完全，且有其他杂质干扰。尤其是针对藻类样品，目前现有前处理方法对于色素的去除非常有限，导致在质谱检测上出现较为明显的基质效应，从而降低检测灵敏度和准确度。此外，由于微囊藻毒素具有多肽类结构，其分子结构中存在羟基与氨基等极性基团，极易生成[Μ+Η]+与[Μ+2Η]2+离子。
[0006]建立一种快速可靠的藻类保健食品中微囊藻毒素的检测方法，对保证藻类保健食品的安全性，促进生产企业的技术创新，提高国产藻类保健食品质量和档次，保障人民群众的身体健康具有重要意义。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是:提供一种操作简便、定性定量能力较强的微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0009]一种微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，包括下列步骤:
[0010](I)样品前处理
[0011]准确称取经过粉碎、均质过的藻类保健品1.0g，用10mL60%甲醇水溶液提取毒素，200rpm摇床震荡60min,再超声处理30min, 20°C以下8000rpm离心10min,取上清液；
[0012]以2mol/L甲酸调节上清液pH值至4.0，静置3h可观察到溶液中出现大量絮状沉淀，20°C以下8000rpm离心10min,得到浅黄色上清液或无色透明液,溶液中加入稀氨水将PH值调至7.0,随后加入超纯水准确定容至30mL，此时得到较为纯净的粗提液；
[0013](2)富集和净化
[0014]首先以IOmL甲醇和IOmL超纯水活化C18固相萃取柱，活化过程流速控制在1_2滴/秒，取15mL粗提液注入C18固相萃取柱进行富集，流速控制在I滴/秒，接着再分别以20%和30%甲醇水溶液各IOmL淋洗C18固相萃取柱，以去除杂质，最后以5mL70%甲醇水溶液(含有0.05%甲酸)洗脱微囊藻毒素，氮气吹至近干，以50%乙腈水溶液定容至0.5mL，待液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测；
[0015]固相提取柱可以起到很好的富集、净化效果，文献报道多用甲醇洗脱，回收率较好。本发明中，在以纯甲醇作为洗脱液的情况下发现MC-LR回收率较好，而MC-RR的回收率极低。在甲醇中添加0.05%浓度的甲酸后再次进行回收率实验，发现MC-RR的回收率显著改善。
[0016](3) LC-MS/MS 检测
[0017]液相条件Waters Atlantis dC18 色谱柱(2.1mmX 150mm, 5 μ m),柱温 30°C ;进样量20 μ L ;流动相A为水(含有0.05%甲酸，5mmol/L甲酸铵)，B为95%乙腈(含有0.05%甲酸，5mmol/L甲酸铵)；梯度洗脱条件见表1:
[0018]表1梯度洗脱条件
[0019]
【权利要求】
1.一种微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，包括下列步骤: (1)样品前处理 准确称取经过粉碎、均质过的藻类保健品1.0 g，用10 mL 60 %甲醇水溶液提取毒素，200 rpm摇床震荡60 min,再超声处理30 min, 20 °C以下8000 rpm离心10 min,取上清液； 调节上清液PH值至4.0，静置3 h可观察到溶液中出现大量絮状沉淀，20 °C以下8000 rpm离心10 min，得到浅黄色上清液或无色透明液，溶液中加入稀氨水将pH值调至6.8-7.2，随后加入超纯水准确定容至30 mL，此时得到较为纯净的粗提液； (2)富集和净化 首先以10 mL甲醇和10 mL超纯水活化C18固相萃取柱，活化过程流速控制在1-2滴/秒，取15 mL粗提液注入C18固相萃取柱进行富集，流速控制在I滴/秒，接着再分别以20%和30 %甲醇水溶液各10 mL淋洗C18固相萃取柱，以去除杂质，最后以5 mL 70 %甲醇水溶液(含有0.05 %甲酸)洗脱微囊藻毒素，氮气吹至近干，以50 %乙腈水溶液定容至0.5mL，待液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测；
(3)LC-MS/MS 检测 液相条件 Waters Atlantis dC18 色谱柱(2.1 mmX 150 πιπι,5μηι),柱温 30 °C ;进样量20 μ L ;流动相A为水(含有0.05%甲酸，5 mmol/L甲酸铵)，B为95 %乙腈(含有0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸铵)；梯度洗脱； 质谱条件离子化方式为电喷雾离子化正模式(ESI+);多反应监测模式(MRM);碰撞气压力(CAD):8 ;气帘气压力(CUR):15 ;电喷雾电压(IS):5000 V ;离子源温度(TEM):600 °C。
2.根据权利要求1所述的微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，步骤(I)溶液中加入稀氨水将PH值调至7.0。
3.根据权利要求1所述的微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，步骤(I)中以2 mol/L甲酸调节上清液pH值至4.0。
4.根据权利要求1所述的微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，步骤(3)中以[M+2H]2+离子作为母离子。
【文档编号】G01N30/02GK103940921SQ201410011060
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】吴振兴, 贾俊涛, 肖西志, 邓明俊, 静平, 许艳丽 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心