一种测定铅离子的磁共振成像传感器的构建方法
【专利摘要】一种测定铅离子的磁共振成像传感器的构建方法，属于纳米生物技术检测领域。本发明包括：磁性纳米粒子分别与一对DNA探针偶联，DNA偶联的磁性纳米粒子在DNA酶的作用下进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号对Pb2+浓度进行检测。本发明提供了一种基于Pb2+依赖的DNA酶组装磁性纳米粒子检测Pb2+的方法，应用DNA修饰的磁性纳米粒子作为探针，DNA偶联的磁性纳米粒子在DNA酶的作用下组装成多聚体，根据不同Pb2+浓度下磁共振信号的差异对Pb2+进行检测。本方法检测限低、灵敏度高、特异性好，同时还能实现高通量的检测需求。
【专利说明】 一种测定铅离子的磁共振成像传感器的构建方法
【技术领域】
[0001]一种测定铅离子的磁共振成像传感器的构建方法，属于纳米生物技术检测领域。【背景技术】
[0002]铅是一种有毒的重金属，铅污染主要来源于各种油漆、涂料、蓄电池、冶炼、五金、机械、电镀、化妆品、染发剂、釉彩碗碟、餐具、燃煤、膨化食品、自来水管等。它通过皮肤、消化道、呼吸道进入体内与多种器官亲和，主要毒性效应是贫血症、神经机能失调和肾损伤，易受害的人群有儿童、老人、免疫低下人群。它可以破坏儿童的神经系统，它可以导致血液循环系统和脑的疾病。长期接触铅和它的盐(尤其是可溶的和强氧化性的PbO2)可以导致肾病和类似绞痛的腹痛。摄入过多的铅及其化合物会导致心悸，易激动，并会使神经系统受损，甚至会致癌和致畸。铅对水生生物的安全浓度为0.16mg/L，用含铅0.1?4.4mg/L的水灌溉水稻和小麦时，作物中铅含量明显增加。国家环保部的调查显示，我国水体重金属污染问题十分突出，江河湖库底质的污染率高达80.1%。针对重金属污染的特点，对其发现和检测是致关重要的。
[0003]传统的Pb2+检测方法主要是仪器分析方法，包括电感偶合等离子体法(ICP)和原子吸收光谱法，虽然这些方法具有高灵敏度、高准确性，但是这些方法需要昂贵的仪器、复杂的样品预处理过程、专业的操作人员，从而导致较高的分析成本。近年来，随着纳米技术在分析检测领域的发展，纳米生物传感器的高灵敏度、高特异性、低成本的优势，引起了人们广泛的研究兴趣，由纳米粒子所制备的各种生物传感器如:比色传感器、手性传感器、表面等离子共振传感器、核磁共振传感器等，在各种食品危害因子的检测中都进行了大量的研究。磁纳米粒子具有顺磁性的特性，不同状态的磁纳米粒子具有不同的横向弛豫时间T2，可以借助于磁纳米粒子的磁共振信号对目标有害物质进行检测。
[0004]DNA酶是经体外筛选得到的一种功能化的DNA分子，可以识别目标物并且催化发生特定的生物化学反应，重金属依赖的DNA酶一般由两条链组成，一条是酶链，一条是底物链，在重金属存在的条件下，会导致底物链发生相应的连接或断裂，Pb2+依赖的DNA酶被称作“8 - 17” DNA酶，酶的底物链包含有RNA切割位点，当存在Pb2+的条件下，底物链的切割位点处会发生断裂，从而表明Pb2+的存在。
[0005]本发明是借助于Pb2+依赖的DNA酶将磁纳米粒子探针组装成多聚体，在不同浓度Pb2+存在的条件下，酶的底物链发生断裂从而导致磁纳米粒子多聚体发生不同程度的解聚，随着Pb2+浓度的增加，解聚程度越大，相应的横向弛豫时间T2随之降低，根据T2弛豫时间与Pb2+浓度之间的对应关系，达到检测Pb2+含量的目的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种核磁共振传感器对Pb2+进行检测与定量，借助于Pb2+依赖的DNA酶将磁性纳米粒子探针组装成多聚体，在不同浓度Pb2+存在的条件下，多聚体发生不同程度的解聚，最后通过核磁共振信号对磁性纳米粒子组装体进行测定，从而间接检测目标Pb2+的含量。
[0007]本发明的技术方案:一种测定铅离子的磁共振成像传感器的构建方法，包括:磁性纳米粒子分别与一对DNA探针偶联，DNA偶联后的磁性纳米粒子在DNA酶的作用下进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测；具体步骤为:
(1)磁性纳米粒子分别与一对DNA探针偶联
所用的分散性良好的磁纳米粒子为羧基功能化的磁性纳米粒子，粒径为10.3±1.6nm，首先磁纳米粒子表面的羧基用碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，即:0.15mg磁性纳米粒子用100 UL 0.01M的PBS (包含50mM NaCl)进行溶解，然后将0.0746mg EDC和0.12mg NHS加入到上述溶液中；活化15min后，取两份上述磁性纳米粒子，向其中分别加入一对DNA探针SI及S2之一种，使DNA探针的终浓度均为I U M，在室温振荡反应4h ；DNA偶联的磁性纳米粒子用截留分子量为3000的超滤管超滤三次，以完全去除未反应的DNA分子,每次在10000r/min的条件下离心5 min ;最终将DNA偶联的磁性纳米粒子重悬到25mM pH7.2的Tris-乙酸缓冲液中，从而得到偶联DNA的磁性纳米粒子探针磁性纳米粒子-SI及磁性纳米粒子-S2 ；
S1:5，-TCACAGATGA GT- NH2_3’ ；
S2:5’- NH2-CACGAGTTGA CA-3’ ；
所述的磁性纳米粒子是Fe3O4纳米粒子，表面含有羧基基团，所用的DNA探针SI的3’端用NH2基团进行修饰，所用的DNA探针S2的5’端用NH2基团进行修饰；
(2)DNA偶联的磁性纳米粒子在DNA酶的作用下进行组装
整个组装过程在100 u L的反应体系中进行，主要包括:以上偶联好的50 y L磁纳米粒子-Sl、50iiL磁纳米粒子-S2、终浓度分别为IiiM的底物链(简称Sub)和2iiM酶链(简称17E)，反应缓冲液为25 mM pH 7.2的Tris-乙酸溶液(包含100 mM NaCl)，将混合溶液加热到70°C，然后将其缓慢降至室`温以促进磁性纳米粒子的组装；过夜反应后得到组装好的磁纳米粒子组装体，再用截留分子量为3000的超滤管超滤3次以去除未杂交的DNA分子，将纯化好的磁纳米粒子用于Pb2+的检测；
Sub: 5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T (rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3’ ；
17E: 5’-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3’ ；
(3)磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号对Pb2+浓度进行检测
将一系列不同浓度的Pb2+加入到上述组装好的磁性纳米粒子中，Pb2+依赖的DNA酶在Pb2+的作用下诱导底物链发生断裂，从而使得磁性纳米粒子聚集体发生不同程度的解聚，再用磁共振信号测定不同样品的横向弛豫时间T2，随着Pb2+浓度的增加，磁性纳米粒子的解聚程度越大，从而使得横向弛豫时间T2越小；得到横向弛豫时间T2与Pb2+浓度之间的关系，绘制标准曲线；从而应用磁共振信号对Pb2+的浓度进行定量测定。
[0008]所述的磁性纳米粒子是Fe3O4纳米粒子，表面含有羧基基团，所用的DNA探针用NH2基团进行修饰，磁性纳米粒子和DNA探针通过EDC法进行偶联。
[0009]本发明的有益效果:本发明提供一种磁共振传感器对Pb2+进行检测与定量，借助于Pb2+依赖的DNA酶将磁性纳米粒子与DNA探针组装成多聚体，在不同浓度Pb2+存在的条件下，多聚体发生不同程度的解聚，最后通过核磁共振信号对磁性纳米粒子组装体进行测定，从而间接检测目标Pb2+的含量。【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1 Pb2+检测的标准曲线；
图2 Pb2+检测的磁共振成像。
【具体实施方式】
[0011]实施例1
一种测定铅离子的磁共振成像传感器的构建方法，包括:磁性纳米粒子分别与一对DNA探针偶联，DNA偶联后的磁性纳米粒子在DNA酶的作用下进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测；具体步骤为:
(1)磁性纳米粒子分别与一对DNA探针偶联
所用的分散性良好的磁纳米粒子为羧基功能化的磁性纳米粒子，粒径为10.3±1.6nm，首先磁纳米粒子表面的羧基用碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，即:0.15mg磁纳米粒子用100 UL 0.01M的PBS (包含50mM NaCl)进行溶解，然后将0.0746mg EDC和0.12mg NHS加入到上述溶液中；活化15min后，取两份上述磁性纳米粒子，向其中分别加入一对DNA探针SI及S2之一种，使DNA探针的终浓度均为I U M，在室温振荡反应4h ；DNA偶联的磁性纳米粒子用截留分子量为3000的超滤管超滤三次，以完全去除未反应的DNA分子,每次在10000r/min的条件下离心5 min ;最终将DNA偶联的磁性纳米粒子重悬到25mM pH7.2的Tris-乙酸缓冲液中，从而得到偶联DNA的磁性纳米粒子探针磁性纳米粒子-SI及磁性纳米粒子-S2 ；
S1:5，-TCACAGATGA G`T- NH2_3’ ；
S2:5’- NH2-CACGAGTTGA CA-3’ ；
所述的磁性纳米粒子是Fe3O4纳米粒子，表面含有羧基基团；
(2)DNA探针偶联后的磁性纳米粒子在DNA酶的作用下进行组装
整个组装过程在100 u L的反应体系中进行，主要包括:以上偶联好的50 y L磁性纳米粒子-Sl、50iiL磁性纳米粒子-S2、终浓度分别为IiiM的底物链(简称Sub)和2iiM酶链(简称17E)，反应缓冲液为25 mM pH 7.2的Tris-乙酸溶液(包含100 mM NaCl)，将混合溶液加热到70°C，然后将其缓慢降至室温以促进磁性纳米粒子的组装；过夜反应后得到组装好的磁性纳米粒子组装体，再用截留分子量为3000的超滤管超滤3次以去除未杂交的DNA分子，将纯化好的磁性纳米粒子用于Pb2+的检测；
Sub: 5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T (rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3’ ；
17E: 5’-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3’ ；
(3)磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测
将一系列不同浓度的Pb2+加入到上述组装好的磁纳米粒子中，Pb2+依赖的DNA酶在Pb2+的作用下诱导底物链发生断裂，从而使得磁性纳米粒子聚集体发生不同程度的解聚，再用磁共振信号测定不同样品的横向弛豫时间T2，随着Pb2+浓度的增加，磁性纳米粒子的解聚程度越大，从而使得横向弛豫时间T2越小；得到横向弛豫时间T2与Pb2+浓度之间的关系，绘制标准曲线；从而应用磁共振信号对Pb2+的浓度进行定量测定。
[0012](4)检测灵敏度研究 根据每个目标Pb2+浓度下对应的核磁共振信号，以Pb2+浓度为横坐标，T2弛豫时间为纵坐标做出一条标准曲线，根据标准曲线计算出Pb2+的检测限为0.05 ng mL—1。
[0013](5)特异性研究
以Mn2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Hg2+、Cu2+代替Pb2+作为检测对象，进行特异性分析，每种重金属的加入浓度均为5 ng mL—1，将反应体系的核磁共振信号与空白样品即未加入任何重金属离子的核磁共振信号进行对比，结果表明两者没有明显的差别，由此得出其它重金属离子不能识别Pb2+依赖的DNA酶，此方法的特异性良好。
[0014](6)添加回收实验
将不同浓度的Pb2+加入到阴性自来水中，用以上方法建立的Pb2+检测磁共振传感器进行水样品中的添加回收测定，最终得到的回收率范围在92.7%- 97.6%，可以应用于实际样品的检测。S1:5，-TCACAGATGA GT- NH2_3’ ；
S2:5’- NH2-CACGAGTTGA CA-3’ ；
Sub: 5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T (rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3’ ；17E: 5’-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3’ ；
【权利要求】
1.一种测定铅离子的磁共振成像传感器的构建方法，其特征在于包括:磁性纳米粒子分别与一对DNA探针偶联，DNA偶联后的磁性纳米粒子在DNA酶的作用下进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测；具体步骤为: (1)磁性纳米粒子分别与一对DNA探针偶联 所用的分散性良好的磁性纳米粒子为羧基功能化的磁性纳米粒子，粒径为10.3±1.6nm,首先磁性纳米粒子表面的羧基用碳二亚胺EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS进行活化，即:0.15mg磁性纳米粒子用100 u L包含50mM NaCl的0.01M的PBS进行溶解，然后将，0.0746mg EDC和0.12mg NHS加入到上述溶液中；活化15min后，取两份上述磁性纳米粒子，向其中分别加入一对DNA探针SI及S2之一种，使DNA探针的终浓度均为I U M，在室温振荡反应4h ；DNA偶联的磁性纳米粒子用截留分子量为3000的超滤管超滤三次，以完全去除未反应的DNA分子,每次在10000r/min的条件下离心5 min ;最终将DNA偶联的磁性纳米粒子重悬到25mM pH7.2的Tris-乙酸缓冲液中，从而得到偶联DNA的磁性纳米粒子探针磁性纳米粒子-SI及磁性纳米粒子-S2 ；
【文档编号】G01N24/08GK103760184SQ201410019078
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】徐丽广, 胥传来, 尹红红, 匡华, 马伟, 宋珊珊, 刘丽强 申请人:江南大学