一种dab2ip蛋白的elisa检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种针对DAB2IP蛋白的ELISA检测方法，该方法采用双抗体夹心ABC法，同时具有高特异性和高灵敏度。所述检测方法具有以下特征：包被DAB2IP单克隆抗体（由保藏号为CCTCC?No.C2013148的细胞株分泌，保藏名称为DAB2IPMab1）于ELISA检测板上作为固相抗体，以生物素标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体，使HRP通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经TMB显色，在450nm单波长处测定吸收值，可以实现DAB2IP蛋白的定量检测。本发明还提供DAB2IP蛋白检测方法的应用。该方法为DAB2IP蛋白的检测及检测产品的开发奠定了基础。
【专利说明】—种DAB21P蛋白的ELISA检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学检测【技术领域】，特别是涉及一种DAB2IP蛋白的检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，其死亡率仅次于心脑血管疾病。全球每年罹患恶性肿瘤人数约有1000万人，其中因肿瘤死亡的病例达700多万，而肿瘤的转移和复发是肿瘤死亡的主要因素。近年来，我国每年新增肿瘤病患160-170万人，呈明显上升趋势。肿瘤治疗康复的关键在于肿瘤的及时准确诊断和治疗。因此，肿瘤诊断对于降低肿瘤病死亡率意义重大。肿瘤的诊断主要依靠检测肿瘤标志物来实现。同时,肿瘤标志物也是肿瘤的病理诊断、治疗和预后判断的重要指标。这些标志物存在于病人的细胞、组织、血液或体液中，检测这些肿瘤标志物的表达水平，对相关恶性肿瘤的早期诊断、治疗效果和预后转归判断等有重要参考价值。
[0003]DAB2IP是一种新发现的抑癌蛋白，它与抑癌蛋白DAB2蛋白的N末端相结合，是DAB2下游的效应蛋白。DAB2IP最初发现与前列腺癌有关，其表达减少常在前列腺癌细胞中检测到，而在正常的前列腺细胞中则表达正常。另外，研究表明DAB2IP蛋白的表达与前列腺癌转移的分级和预后呈负相关，故监测低表达的DAB2IP对于前列腺癌的预测和诊治具有重要意义。Dote等发现DAB2IP的基因沉默对胃肠癌和乳腺癌的发生发展和侵袭转移起重要作用。Yano等认为DAB2IP可作为肺癌发生的一个生物标志物。而越来越多的研究表明DAB2IP作为重要的抑癌基因，在乳腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌等多种肿瘤发生发展和预后等方面都发挥了举足轻重的作用。
[0004]作为一种新发现的抑癌蛋白，关于DAB2IP的失活机制、抑癌机理及其与多种肿瘤的关系正在不断被深入研究。对DAB2IP的进一步研究，将为肿瘤诊断提供新途径，并有望成为治疗肿瘤的突破口之一。DAB2IP的去甲基化治疗，DAB2IP再表达和依据DAB2IP信号通路蛋白设计肿瘤抑制剂类药物，将为肿瘤治疗提供新的思路。
[0005]因此，针对DAB2IP蛋白的检测方法一方面为临床肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、观察疗效、监测复发以及预后评价提供一个新的参考指标和检测工具；另一方面为全面揭示DAB2IP蛋白的作用机制以及与临床肿瘤的关系的研究提供了一个新手段。蛋白检测方法相对于核酸检测法，避免了蛋白表达的时空调控导致的误差，具有更直接准确的优势。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种人DAB2IP蛋白的检测方法。
[0007]在一方面，本发明提供了一种DAB2IP蛋白的检测方法，所述方法包括以包被于ELISA检测板上的DAB2IP单克隆抗体作为固相抗体和标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体进行双抗体夹心法，以定量检测DAB2IP蛋白。优选地，所述DAB2IP单克隆抗体来自抗人肿瘤抑制因子DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC N0.C2013148。[0008]在一个具体的实施方案中，所述检测方法包括:以包被于ELISA检测板上的DAB2IP单克隆抗体作为固相抗体，以生物素标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体，通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经显色，以定量检测实现DAB2IP蛋白。
[0009]在一个实施方案中，所述显色剂是辣根过氧化物酶(HRP)，在这种情况下经四甲基联苯胺(TMB)显色，在400-700nm，优选450nm单波长测定吸收值，以定量检测实现DAB2IP蛋白。
[0010]本发明的方法为DAB2IP蛋白的检测及相关检测产品的开发奠定基础。
[0011]在一个实施方案中，本发明的生物素标记的DAB2IP多克隆抗体是按以下步骤得到的:
[0012]将DAB2IP多克隆抗体溶解在PBS缓冲液中(优选浓度2mg/ml )，加入生物素(优选生物素为抗体分子数的1-40倍，更 优选5-30倍，还更优选10-20倍)，在冰上静置，经纯化得到纯的生物素化抗体。
[0013]本发明中的DAB2IP单克隆抗体可以参见本 申请人:于2014年I月9日提交的，申请号为201410009739.9、发明名称为“一种抗人DAB2IP的单克隆抗体及其细胞株”的发明专利申请，其全文引入本文作为参考。
[0014]在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体是按以下步骤制备的:将DAB2IP基因(SEQ ID N0.1)重组到改造过的pET32a载体上，该载体同时含有6His tag和TRX tag，并在6His tag和多克隆位点之间含有TEV酶切位点；将重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中进行表达，所表达的蛋白为TRX-6His-DAB2IP(SEQ ID N0.2)融合蛋白，经TEV(S219V)酶切及二次镍柱和分子筛纯化，得到纯化的DAB2IP蛋白；利用该纯化的DAB2IP蛋白免疫小鼠，经细胞融合及亚克隆化得到单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌产生单克隆抗体。
其中，SEQ ID N0.1如下:
【权利要求】
1.一种DAB2IP蛋白的检测方法，所述方法包括以包被于ELISA检测板上的DAB2IP单克隆抗体作为固相抗体和标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体进行双抗体夹心法，以定量检测DAB2IP蛋白。
2.权利要求1的方法，所述DAB2IP单克隆抗体来自抗人肿瘤抑制因子DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC N0.C2013148。
3.权利要求1或2的方法，包括所述检测方法:以包被于ELISA检测板上的DAB2IP单克隆抗体作为固相抗体，以生物素标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体，通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经显色，以定量检测DAB2IP蛋白。
4.权利要求3的方法，所述显色剂是辣根过氧化物酶(HRP)，在这种情况下经四甲基联苯胺(TMB)显色，在450nm单波长测定吸收值，以定量检测实现DAB2IP蛋白。
5.权利要求1或2的方法，所述生物素标记的DAB2IP多克隆抗体是按以下步骤制备的: 将DAB2IP多克隆抗体溶解在PBS缓冲液中(优选浓度2mg/ml )，加入生物素(优选生物素为抗体分子数的1-40倍，更优选5-30，还更优选10-20倍)，在冰上静置，经纯化得到纯的生物素化抗体。
6.权利要求1或2的方法，所述单克隆抗体是按以下步骤制备的:将DAB2IP基因重组到改造过的pET32a载体上，该载体同时含有6His tag和TRX tag，并在6His tag和多克隆位点之间含有TEV酶切位点；将重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中进行表达，所表达的蛋白为TRX-6His-DAB2IP融合蛋白，经TEV酶切及二次镍柱和分子筛纯化，得到纯化的DAB2IP蛋白；利用该纯化的DAB2IP蛋白免疫小鼠，经细胞融合及亚克隆化得到单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌产生单克隆抗体。
7.权利要求1或2的方法，所述多克隆抗体是按以下步骤制备的:利用权利要求6纯化的DAB2IP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。
8.权利要求1或2的方法，所述DAB2IP的定量检测是按以下方法完成的:将DAB2IP标准蛋白进行梯度稀释，然后分别用此方法测定400-700nm，优选450nm单波长时的读数，制作一个标准曲线，再将要测定的样品用此法在相同波长所测得的读数带入标准曲线，得到其实际浓度。
【文档编号】G01N33/68GK103983784SQ201410052911
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】吴允昆, 苏银桃, 李生平, 谢佐福, 施方媛, 曾占壮, 赵艳和 申请人:中国科学院福建物质结构研究所