检测h7亚型禽流感病毒的胶体金试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测H7亚型禽流感病毒的胶体金试纸条。本发明提供的一种用于检测H7亚型禽流感病毒胶体金免疫层析试纸条,包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有金标抗体的偶联垫、含有检测线T和质控线C的NC膜和吸水垫;所述金标抗体为胶体金标记H7亚型禽流感病毒单克隆抗体。本发明用样品垫、偶联垫、检测线和质控线标记的NC膜、吸收垫按照以下工艺组装在支持板上,其中偶联垫上灌注有H7金标单克隆抗体,检测线和质控线由H7多克隆抗体和兔抗鼠lgG喷膜构成。本发明的试纸条具有以下优点:操作操作简单,特异性好、敏感性高、诊断结果可靠;适用于H7亚型禽流感病毒感染的现场检测,尤其适用基层单位或个人的现场快速检测。
【专利说明】检测H7亚型禽流感病毒的胶体金试纸条
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】,尤其涉及检测H7亚型禽流感病毒的胶体金试纸条。
【背景技术】
[0002]自2002年以来,全球(荷兰、意大利、加拿大、美国以及英国等国家)报道的人感染H7亚型禽流感病毒(AIV H7)病例高达247人。根据中国疾控中心数据统计,2013年3月31日至2013年8月15日,中国上海、北京、江苏、浙江、安徽、福建江西、山东、河南、湖南等10个省份共报道了 134例H7N9亚型禽流感病毒(AIVs)人感染病例,台湾确诊病例I人,其中45人死亡。H7亚型禽流感病毒不仅影响养禽业的健康发展,并且严重威胁人类的生命健康。为了有效地控制H7亚型禽流感病毒的传播,各国学者正致力于研发各种检测H7亚型禽流感病毒的方法。
[0003]目前检测AIV的主要方法有病毒分离鉴定、酶联免疫吸附(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)以及GeXP方法等。胶体金免疫层析分析(gold-1mmunochromatography assay, GI CA)是近年发展起来的一种以胶体金为标记物,通过抗原抗体免疫学反应对样本中的生物大分子进行定性分析的免疫学分析技术。胶体金作为免疫标记物应用于免疫学分析始于1971年,随着1989首次以胶体金为标记物开发的艾滋病抗体渗滤检测试剂诞生以来,免疫胶体金快速检测技术在生命医学诊断各个领域中得到了广泛应用。目前尚未有H7亚型禽流感病毒快速检测的免疫胶体金试纸条的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一种用于检测H7亚型禽流感病毒胶体金免疫层析试纸条。
[0005]本发明提供的试纸条,包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有金标抗体的偶联垫、含有检测线T和质控线C的NC膜和吸水垫;
[0006]所述金标抗体为胶体金标记H7亚型禽流感病毒单克隆抗体。
[0007]上述试纸条中,
[0008]所述胶体金的粒径为15_25nm。
[0009]上述试纸条中,
[0010]所述检测线T由H7亚型禽流感病毒的多克隆抗体形成;
[0011]所述质控线C由鼠源抗IgG抗体形成。
[0012]上述试纸条中,
[0013]所述鼠源抗IgG抗体为兔抗鼠IgG ;
[0014]上述H7亚型禽流感病毒的多克隆抗体具体为H7N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体。
[0015]本发明的另一个目的是提供一种制备上述的试纸条的方法。[0016]本发明提供的方法,包括如下步骤:
[0017]I)先将胶体金溶液和H7亚型禽流感病毒单克隆抗体混匀,反应,收集固体反应物,再将所述固体反应物经BSA封闭,即得到金标抗体;
[0018]在所述步骤I)的所述封闭后,还包括如下步骤:将所述封闭的产物收集沉淀,再溶解,得到金标抗体。
[0019]上述封闭采用的缓冲液为含有质量百分含量为1%的BSA的20mmol/L硼酸钠水溶液;
[0020]所述溶解采用的缓冲液为含有1%BSA和0.1%叠氮钠的20mmol/L的硼酸钠水溶液。
[0021]2)制备灌注有金标抗体的偶联垫和含有检测线T和质控线C的NC膜;
[0022]所述灌注有金标抗体的偶联垫为将所述金标抗体灌注到玻璃纤维棉上、干燥,SP得到偶联垫;上述干燥为真空冻干;用于灌注金标抗体的玻璃纤维棉为将玻璃纤维棉放入含5%BSA,2%蔗糖,0.8%NaCl和0.05%NaN3的PBS处理液中20min,37°C恒温烘干,得到。
[0023]所述含有检测线T和质控线C的NC膜为将H7亚型禽流感病毒多克隆抗体和鼠源抗IgG抗体分别点射于NC膜上,形成含有检测线T和质控线C的NC膜;
[0024]3)将所述NC膜、样品垫、所述偶联垫和吸水垫组装到支持板,得到胶体金免疫层析试纸条。
[0025]上述方法中,
[0026]步骤I)中,所述胶体金溶液和所述H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的加料体积比为 200:1 ;
[0027]所述H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的浓度为lmg/mL ;
[0028]所述胶体金溶液中的胶体金的粒径为15_25nm;
[0029]所述反应为25°C搅拌30min ;
[0030]所述胶体金溶液的pH值为9.0 ;
[0031]步骤2)中,所述鼠源抗IgG抗体为兔抗鼠lgG。
[0032]上述方法中,
[0033]所述胶体金溶液按照如下方法制备:四氯金酸水溶液和柠檬酸钠水溶液混匀,反应,得到胶体金溶液;所述柠檬酸钠和所述四氯金酸的质量比为5:1 ;
[0034]所述四氯金酸水溶液的反应温度为97°C ;
[0035]所述反应依次为A、B:A为97°C反应IOmin ;B为25°C搅拌lOmin。
[0036]上述方法中,
[0037]所述H7亚型禽流感病毒多克隆抗体为H7N2亚型禽流感病毒多克隆抗体。
[0038]上述的胶体金免疫层析试纸条在制备检测或辅助检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用也是本发明保护的范围。
[0039]本发明的实验证明,本发明用样品垫、偶联垫、检测线和质控线标记的N C膜、吸收垫按照以下工艺组装在支持板上,其中偶联垫上灌注有H7金标单克隆抗体,检测线和质控线由H7多克隆抗体和兔抗鼠IgG喷膜构成。本发明的试纸条具有以下优点:操作操作简单,特异性好、敏感性高、诊断结果可靠;适用于H7亚型禽流感病毒感染的现场检测,尤其适用基层单位或个人的现场快速检测。【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为试纸条结构示意图
[0041]图2为试纸条结果判定
[0042]图3为传感器灵敏度检测结果
[0043]【具体实施方式】
[0044]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0045]下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0046]H7N2 亚型禽流感病毒(Duck/HK/47/76H7N2)、H5N1 亚型禽流感病毒(Chicken/Guangxi/1/04H5N1)、H1N3 亚型禽流感病毒(Duck/HK/717/79_dlHlN3)、H9N2 亚型禽流感病毒(Duck/Guangxi/1/00H9N2)均记载在:A multiplex RT-PCR for detection of typeA inf I uenza virus and differentiation of avian H5, H7, and H9hemagglutininsubtypes ;Zhixun Xie, Yao-shan Pang, Jiabo Liu, Xianwen Deng, Xiaofei Tang, JianhuaSun, Mazhar 1.Khan ;Molecular and Cellular Probes20 (2006) 245 - 249 中;公众可均从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0047]NDV毒株GX1/00记载在文献:陈安莉,谢芝励,周辰瑜,等.新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2011,41 (09):917-922 ;公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0048]IBV毒株Massachussetts41记载在文献:谢志勤,谢芝励,吕华刚.等.30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分尚株SI基因的克隆及序列分析[J].西南农业学报,2008,21 (6):1733-1736 ;公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0049]其中,H7N2亚型禽流感病毒(Duck/HK/47/76H7N2)病毒含量为 27HA unit/50ul ;
[0050]Hl亚型禽流感病毒含量为28HA unit/50ul
[0051]H5亚型禽流感病毒含量为29HA unit/50ul
[0052]H9亚型禽流感病毒含量为29HA unit/50ul
[0053]NDV 毒株 GX1/00 病毒含量为 27HA unit/50ul
[0054]IBV 毒株 Massachussetts41 病毒含量为 105_7EID5(l/ml。
[0055]实施例1、胶体金免疫层析试纸条的制备
[0056]1、胶体金溶液的制备
[0057]准确移取lmLl%HAuCl4溶液于150mL锥形瓶中,加水至总体积约为95mL,得到四氯金酸水溶液;水浴加热至97°C,在搅拌条件下加入5.0mL10g/L柠檬酸钠水溶液,混匀得到混合液(HAuCl4和柠檬酸钠的质量配比1:5);再将混合液置于97°C水浴中加热IOmin (搅拌),再在室温(25°C)下搅拌lOmin,自然冷却后,得到胶体金溶液,用水定容到IOOmL容量瓶中。
[0058]胶体金的粒径为15_25nm。
[0059]2、金标抗体的制备
[0060]用0.lmol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH值为9.0 ;
[0061]向10ml pH值为9.0胶体金溶液中的加入50 μ L浓度为lmg/mL H7禽流感病毒单克隆抗体,常温25°C搅拌30min, 5200g离心20min,弃上清收集沉淀;再向沉淀中加入含有质量百分含量为1%的BSA的20mmol/L硼酸钠水溶液,25°C搅拌30min进行封闭,9000g离心20min,弃上清收集沉淀;将沉淀分散在Iml含有1%BSA和0.1%叠氮钠的20mmol/L的硼酸钠水溶液中,使金标抗体恢复至原体积的1/10,放置在4°C冰箱保存备用,得到金标抗体。
[0062]H7亚型禽流感病毒单克隆抗体购自abeam公司,产品代码:ab82458,产品链接网址:http://www.abeam.cn/InfIuenza-A-Virus-Hemagglutinin-H7-antibody-lHll-ab82458-references, html。
[0063]3、胶体金免疫层析试纸条的研制
[0064]H7亚型禽流感病毒多克隆抗体为H7亚型禽流感鸡阳性血清:购自哈尔滨维科生物技术开发公司,经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性,浓度为0.2mg/mL。
[0065]试纸条主要由NC 膜(NC-al01Milliporel35,孔径为 8 μ m,2.5cmX30cm,有背衬,Millipore)、样品垫(BT50,厚度0.52mm,吸水量53mg/cm2,上海金标生物科技有限公司)、偶联垫(SB08,厚度0.33mm,吸水量63.1mg/cm2,上海金标生物科技有限公司)、吸水垫(CH27,厚度0.69mm,吸水速度65.8s/4cm,吸水量62.5mg/cm2,上海金标生物科技有限公司)和支持板(PVC胶板)等五部分构成。
[0066]将NC膜置于BIODOT XYZ喷点系统(XYZ3200)平台上展平压紧,200 μ L0.2mg/mLH7亚型禽流感病毒多克隆抗体放于A池,200 μ Llmg/mL兔抗鼠IgG放于B池,开机后将H7亚型禽流感病毒多克隆抗体和兔抗鼠IgG(产品编号BA1048,博士德生物)分别点射于NC膜上,形成检测线(T)和质控线(C)。室温25°C自然晾干后,将其浸泡入封闭液(1%BSA的PBS缓冲液,pH=7.4)中30min,37°C烘干后,加入干燥剂,4°C密封保存,得到含有检测线(T)和质控线(C) NC膜;
[0067]将玻璃纤维棉裁成IOmm的细条,放入含5%BSA,2%蔗糖,0.8%NaCl和0.05%NaN3的PBS处理液中20min,37°C恒温烘干,然后将由上述2制备的金标抗体灌注在已处理好的玻璃纤维棉上,真空冻干4h,即为偶联垫;
[0068]样品垫要用含2%BSA,1%蔗糖,0.5%硼酸钠和0.l%NaN3的PBS处理后,37°C干燥备用;
[0069]在支持板上,将NC膜、样品垫、偶联垫、吸水垫等按如下工艺组装在一起(如图1所示)=NC膜的底面粘贴在支持板上面,在该NC膜的两端上分别粘贴偶联垫和吸水垫在该玻璃纤维膜的另一端粘贴样品垫,叠压宽度为2mm。用切割机制成3.5mm宽的试纸条,刚入带干燥剂的密闭容器中储存,得到胶体金免疫层析试纸条。
[0070]试纸条的检测原理:试纸条根据“抗体-抗原-抗体”夹心免疫层析原理设计。滴加样品后,在NC膜的毛细作用下,样品溶液向上迁移,达到偶联垫时,金标抗体将被溶解。当样品中为H7亚型禽流感病毒阳性时,H7亚型禽流感病毒将和金标抗体结合,并一起向上迁移,达到固定有H7亚型禽流感病毒多克隆抗体的检测线T时,形成“H7亚型禽流感病毒多克隆抗体-H7亚型禽流感病毒-金标抗体”复合物,最终形成一条红色沉淀线,而未被固定的金标抗体继续上行至兔抗鼠IgG处,形成“金标抗体-兔抗鼠IgG”复合物,形成红色沉淀线,此线为质控线C。当样品为H7亚型禽流感病毒阴性时,金标抗体溶解在样品中,并一起向上迁移,达到固定有H7亚型禽流感病毒多克隆抗体的检测线T时,不能被固定,检测线T处不出现红色条带(未被固定的金标抗体继续上行至兔抗鼠IgG处,形成“金标抗体-兔抗鼠lgG”复合物,形成红色沉淀线,此线为质控线C。试纸条的阴性和阳性结果如图2所示。
[0071]实施例2、胶体金免疫层析试纸条的特异性和灵敏度检测
[0072]1、特异性检测
[0073]以下灭活的禽流感病毒为37°C下用0.1%甲醛振荡灭活对应亚型禽流感病毒毒株4小时得到。
[0074]以灭活H7N2亚型禽流感病毒(阳性对照,H7)、灭活H5N1亚型禽流感病毒(H5)、灭活H1N3亚型禽流感病毒(Hl)、灭活H9N2亚型禽流感病毒(H9 )、新城疫病毒(NDV) GX1/00和传染性支气管炎病毒(IBV)Massachussetts41为待测样品,用由实施例1制备的胶体金免疫层析试纸条进行检测,检测方法如下:将待测样品用PBS溶液(pH=7.4,含0.8%NaCl)稀释10倍,即IOyL待测样品加入90μ L PBS溶液,混合均匀,滴加到试纸条的样品孔(S)中,任其沿着试纸条自由扩散,15min内观察结果。
[0075]结果:灭活H7N2亚型禽流感病毒在T线和C线位置同时出现两条红色反应带,结果判定为阳性;灭活H5N1亚型禽流感病毒(H5)、H1N3亚型禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒只在C线位置出现一条红色反应带,结果判定为阴性。
[0076]2、灵敏度检测
[0077]SPF鸡泄殖腔棉试纸样品(健康鸡)作为阴性对照,以PBS缓冲溶液将H7N2亚型禽流感病毒(Duck/HK/47/76H7N2)分别稀释 10 倍、50 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500倍、600倍、700倍,用由实施例1制备的胶体金免疫层析试纸条按照如下步骤的方法进行检测。
[0078]结果如图3所示,10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍在T线和C线位置同时出现两条红色反应带,结果判定为阳性,500倍、600倍、700倍的样品只在C线位置出现一条红色反应带,结果判定为阴性。结果说明该试纸条的灵敏度为1: 400。
[0079]因此,用上述试纸条检测或辅助检测待测样品是否含有H7亚型禽流感病毒,
[0080]若检测线T处和质控线C处均出现两条红色反应带,结果判定为阳性,待测样品含有或候选含有H7亚型禽流感病毒;
[0081]若仅有质控线C处出现I条红色反应带,结果判定为阴性;待测样品不含有或候选不含有H7亚型禽流感病毒;
[0082]其他情况,均为无效试纸条。
[0083]3、对照常规方法检测
[0084]用Dot-ELYSA检测,具体方法以PBS缓冲溶液将H7N2亚型禽流感病毒(Duck/HK/47/76H7N2)分别稀释 10 倍、50 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、600 倍、700 倍,分别取5μ L点样于硝酸纤维素膜(N C膜,孔径0.45 μ m,浙江黄岩人民化工厂产品)光面,37°C干燥后,于5%脱脂奶中封闭I h,取出N C膜,P B S T洗涤3次,每次IOm i η ;加1: 200稀释的Η7单克隆抗体37°C孵育I h,P B S T洗漆3次后,再加1: 200稀释的HPR标记的兔抗鼠lgG,37°C孵育I h,P B S T洗漆3次后于D A B中显色15 m i η,PBS T洗涤N C膜,膜上出现棕色斑点者判为阳性。
[0085]结果显示,10倍、50倍、100倍、200倍、300倍出现棕色斑点,400倍、500倍、600倍、
700倍的样品没有出现棕色斑点,Dot-ELYSA检测灵敏度为1: 300。 [0086] 因此,本发明的方法灵敏度高。
【权利要求】
1.一种用于检测H7亚型禽流感病毒胶体金免疫层析试纸条,包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有金标抗体的偶联垫、含有检测线T和质控线C的NC膜和吸水垫; 所述金标抗体为胶体金标记H7亚型禽流感病毒单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于: 所述胶体金的粒径为15-25nm。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条,其特征在于: 所述检测线T由H7亚型禽流感病毒的多克隆抗体形成; 所述质控线C由鼠源抗IgG抗体形成。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试纸条,其特征在于: 所述鼠源抗IgG抗体为兔抗鼠IgG ; 所述H7亚型禽流感病毒的多克隆抗体为H7N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体。
5.一种制备权利要求1-4中任一所述的试纸条的方法,包括如下步骤: 1)先将胶体金溶液和H7亚型禽流感病毒单克隆抗体混匀,反应,收集固体反应物,再将所述固体反应物经BSA封闭,即得到金标抗体; 2)制备灌注有金标抗体的偶联垫和含有检测线T和质控线C的NC膜; 所述灌注有金标抗体的偶联垫为将所述金标抗体灌注到玻璃纤维棉上、干燥,得到偶联垫; 所述含有检测线T和质控线C的NC膜为将H7亚型禽流感病毒多克隆抗体和鼠源抗IgG抗体分别点射于NC膜上,形成含有检测线T和质控线C的NC膜; 3)将所述NC膜、样品垫、所述偶联垫和吸水垫组装到支持板,得到胶体金免疫层析试纸条。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于: 步骤I)中,所述胶体金溶液和所述H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的加料体积比为200:1 ; 所述H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的浓度为lmg/mL ; 所述胶体金溶液中的胶体金的粒径为15-25nm ; 所述反应为25°C搅拌30min ; 所述胶体金溶液的PH值为9.0 ; 步骤2)中,所述鼠源抗IgG抗体为兔抗鼠lgG。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于: 所述胶体金溶液按照如下方法制备:四氯金酸水溶液和柠檬酸钠水溶液混匀,反应,得到胶体金溶液;所述柠檬酸钠和所述四氯金酸的质量比为5:1 ; 所述四氯金酸水溶液的反应温度为97°C ; 所述反应依次为A、B:A为97°C反应IOmin ;B为25°C搅拌IOmin。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于: 所述H7亚型禽流感病毒多克隆抗体为H7N2亚型禽流感病毒多克隆抗体。
9.权利要求1-4所述的胶体金免疫层析试纸条在制备检测或辅助检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK103941005SQ201410052927
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】谢芝勋, 黄娇玲, 罗思思, 谢志勤, 谢丽基, 刘加波, 庞耀珊, 范晴 申请人:广西壮族自治区兽医研究所