一种基于纳米金的水中病原微生物检测方法
【专利摘要】本发明提出了一种基于纳米金粒子的水中病原微生物检测方法，属于纳米生物技术检测领域。本发明的主要特征在于利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法。待检测病原微生物特殊引物（探针）的消耗，导致纳米金粒子重新暴露在盐浓度下发生聚集，使其颜色和吸光度值发生变化，通过肉眼观察和吸光度值的测量可以对靶DNA进行定性检测。该方法简洁、成本低廉、特异性和灵敏度都较高，可以应用到野外分析以及应急水事件中病原微生物的检测。
【专利说明】一种基于纳米金的水中病原微生物检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米生物技术检测领域，具体涉及一种使用纳米金粒粒子溶液的颜色为检测信号，在体系中将水中病原微生物引物作为纳米金粒子稳定剂的检测比色方法。
【背景技术】
[0002]众所周知，微生物污染是饮用水最常见的健康风险之一。目前，饮用水中发现的病原微生物种类已超过140种，它们对人类健康有着严重的威胁。根据世界卫生组织(WHO)的数据，每年有400万以上的儿童死于水传疾病(World Health Organization, 2011)。我国在近10年间发生的271起饮用水突发污染公共事件中，微生物污染案例占据主导，造成3万余人罹患疾病。对水传病原微生物进行准确检测，是保障水质安全的必要手段。
[0003]目前日常的水质微生物学检测主要采用基于培养的平皿计数法、多管发酵法(GB/T 5750,2006)进行，由于环境中大部分微生物处于有活性但无法培养(viable butnon-culture, VBNC)的状态，这些传统方法往往会低估或者漏查病原微生物的数量或种类。另外，培养法虽然对设备和技术条件要求不高，但操作繁琐且耗时较长，在目前水源水和饮用水污染事故发生较为频繁的情况下，无法满足现场或应急检测快速定性的要求。而以定量PCR技术为代表的新型分子生物学技术可以通过标记有放射性、荧光和化学发光物质的探针与靶序列的杂交实现对水中可培养和不可培养的病原微生物的快速检测，但其设备和试剂成本较高，且标记物质对人体往往具有一定的毒性，本身具有一定的污染风险。
[0004]纳米金粒子(AuNPs)具有良好的生物相容性且无毒副作用，在生命科学，材料科学以及临床医学等领域均有广泛应用。另外，分散在溶液中的纳米金粒子重新聚集会产生肉眼可见的明显颜色变化，是理想的颜色信号元件。
[0005]现有技术未公开不修饰的纳米金对水中病原微生物检测的技术方案。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提出了一种基于纳米金粒子的水中病原微生物检测方法。此发明首次利用不修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物种类，具体使用待检测病原微生物特殊引物(探针)作为纳米金粒子的稳定剂，通过其含量变化导致纳米金粒子稳定性变化，最终造成反应体系的颜色和吸光度值发生变化，纳米金粒子作为颜色信号元件。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
一种利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法。使用待检测病原微生物特殊引物(探针)作为稳定剂，纳米金粒子作为颜色信号元件。
[0008]更确切地，本发明所述的方法具体包括如下步骤:
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸方法制备纳米金粒子溶液，
(2)采用富集方法获得水样样品，
(3)采用裂解方法获得水样DNA粗提产物，
(4)采用特定的条件对水样样品进行PCR扩增反应， (5)采用特定的体积混合步骤(I)和(4)中溶液，并加入PBS缓冲液，观察溶液颜色变化或对溶液进行检测，得到相应的紫外可见光谱。
[0009]根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤(I)中柠檬酸钠还原法是利用1%的氯金酸溶液还原制备得体系为50ml纳米金粒子溶液,纳米金粒子粒径约为15nm。
[0010]根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤(2)中富集方法为滤膜截留水样中的微生物得到水样样品，滤膜孔径为0.22-0.45 μ m,材质为混合纤维素酯膜，优选0.22 μ m。
[0011]根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤(3)中裂解液成分为浓度0.1-1%的十二烷基磺酸钠(SDS)，优选 0.5%ο
[0012]根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤(4)中PCR扩增条件统一设定为95° C，预变性5min ;95° C，45s，55.5° C，45s，72。C，45s，进行 35 个循环反应；72。C, IOmin0
[0013]根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤(5)中选取PCR产物体系为10 μ 1，纳米金粒子溶液体系为90 μ 1，PBS缓冲溶液的终浓度为2.5mM-12.5mM，优选2.5mM ;纳米金粒子溶液与PBS缓冲溶液体积比为 1:10-1:2，优选 1:3 (30μ 1: 90μ1)。
[0014]根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤(5)中反应时间为Ι-lOmin，优选5min。
[0015]根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤(5)中测定吸光度值范围为450nm-750nm，测定仪器为酶标仪。
[0016]更具体地，本发明所述检测水中病原微生物的方法，包括如下步骤:
(1)采用准确称重的柠檬酸三钠还原Iml1%的氯金酸方法制备得到50ml的纳米金粒子溶液，
(2)待测水样通过0.22-0.45 μ m混合纤维素酯膜，直至抽滤无法进行，
(3)剪碎(2)中混合纤维素酯膜于1.5ml离心管，加入Iml裂解液，80° C水浴，15min，
(4)取(3)中离心管，微离，取上清液2ul作为PCR反应模板，PCR扩增条件统一设定为95。C，预变性 5min ;95° C, 45s, 55.5° C, 45s, 72° C，45s，进行 35 个循环反应；72° C，IOmin0
[0017](5)取(I)中纳米金粒子溶液90μ I与(2)中产物10μ I混合，加入终浓度为
2.5-12.5mM的PBS缓冲溶液，1-1Omin后，观察颜色变化，另取100 μ I混合溶液加入96微孔板于酶标仪上测量450_750nm的吸光度值。
[0018]本发明将PCR反应产物加入到纳米金粒子溶液中。一定时间后，加入PBS缓冲溶液。由于用于PCR反应的引物能使纳米金粒子抵抗盐离子，导致纳米金粒子溶液没有颜色变化。当水体中存在引物对应的病原微生物，引物会被消耗，纳米金粒子就会重新暴露在盐离子下，从而发生聚集，最终造成溶液颜色发生变化。颜色的变化与水中病原微生物有关，故该发明可用于检测水中病原微生物的种类。
[0019]本发明所述的技术方案所用的纳米金粒子稳定剂为PCR反应引物，无需额外添加底物，方便简单；本发明所需纳米金颗粒无需标记巯基(-SH)，磁珠或荧光物质等材料，降低了耗材成本；此外，本发明的检测灵敏度较高，只需PCR过程有特异性片段产生，就能通过肉眼可见的溶液颜色变化对相应病原微生物进行定性，适合条件相对不优越的现场检测，有较好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是本发明中5种待测病原微生物菌株的PCR产物与不修饰的纳米金粒子显色反应的紫外可见光谱图。
[0021]如图，不匹配的非特异性探针(图1中Control,实心正方形)不会结合特定的PCR产物，游离的探针包裹纳米金颗粒形成保护，吸光度峰值保持530nm左右不变，OD高达
0.36 ;而匹配的特异性探针(图1中5株实验用菌，其他形状)，由于探针的数量减少甚至消失，纳米金颗粒在一定的盐浓度下发生聚合，吸光度值下降，峰值范围约0.2-0.26，对应的溶液颜色变化为紫色或近于无色。
【具体实施方式】实施例
[0022]( I)纳米金粒子溶液的制备
纳米金粒子溶液采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得。其具体制备过程为:
取48ml超纯水+Iml 1%氯金酸加热至90-100° C，回流，再加入准确称取0.0714g柠檬酸三钠(用Iml超纯水溶解)，继续加热10-15min后停止加热，冷却至室温，得到一定浓度实验用纳米金溶液。纳米金粒子大小与加入的柠檬酸三钠的量有关。
[0023](2)待测病原微生物引物设计
木文例选収5种常见水传病化微卞物设到儿相1、mi物αα如K灰:
【权利要求】
1.一种基于纳米金粒子的水中病原微生物检测方法，其特征在于利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法；待检测病原微生物特殊引物(探针)的消耗，导致纳米金粒子重新暴露在含盐的溶液中而发生聚集，其颜色和吸光度值发生变化，通过肉眼观察和吸光度值的测定可以对靶DNA进行定性检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米金粒子的水中病原微生物检测方法，其特征在于利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法包括如下步骤: (1)采用柠檬酸钠还原氯金酸方法制备纳米金粒子溶液， (2)采用富集方法获得水样样品， (3)采用裂解方法获得水样DNA粗提产物， (4)采用特定的条件对水样样品进行PCR扩增反应， (5)采用特定的体积混合步骤(I)和(4)中溶液，并加入PBS缓冲液，观察溶液颜色变化或对溶液进行检测，得到相应的紫外可见光谱。
3.根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤(I)中柠檬酸钠还原法是利用1%的氯金酸溶液还原制备得体系为50ml纳米金粒子溶液,纳米金粒子粒径约为15-20nm。
4.根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤(2)中富集方法为滤膜截留水样中的微生物得到水样样品，滤膜孔径为0.22-0.45 μ m，材质为混合纤维素酯膜。
5.根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，所述步骤(3)中裂解液成分为浓度0.1-1%的十二烷基磺酸钠(SDS)。
6.根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤(4)中PCR扩增条件统一设定为95° C，预变性5min ;95° C，45s，55.5° C，45s，72。C，45s，进行 35 个循环反应；72。C, IOmin0
7.根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤(5)中选取PCR产物体系为5-15 μ 1，纳米金粒子溶液体系为60-90 μ I，PBS缓冲溶液的终浓度为2.5mM-12.5mM ;纳米金粒子溶液与PBS缓冲溶液体积比为 1:10-1:2。
8.根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤(5)中反应时间为l-10min。
9.根据权利要求2所述的利用无基团修饰的纳米金粒子检测水中病原微生物的比色法，其特征在于，步骤(5)中测定吸光度值范围为450nm-750nm，测定仪器为酶标仪。
【文档编号】G01N21/78GK103822917SQ201410061370
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】于鑫, 叶成松, 王春明 申请人:中国科学院城市环境研究所