一种检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒及其应用的制作方法

文档序号:6218811阅读:388来源:国知局
一种检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒,包括A液和B液,所述A液是将Gly-Pro-X多肽粉末溶解于PIPES缓冲液中制备而成,所述B液是将四氮唑盐、PMS和NaCl溶解于PIPES缓冲液中制备而成。本发明还公开了检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒在检测二肽基肽酶Ⅳ活性方面的应用。本发明水溶性四唑盐以其独特的反应灵敏性和反应产物无毒性,将水溶性四氮唑盐作为二肽基肽酶Ⅳ活性检测的指示剂,既能达到高灵敏度的检测范围又对实验者和环境无任何污染。
【专利说明】一种检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】,具体涉及一种检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]二肽基肽酶IV在真核生物中能够介导T淋巴细胞和抗原递呈细胞之间的信号通路,例如涉及2型糖尿病病理过程中的信号传导过程,在免疫反应中具有重要生物学功能,目前更是成为免疫疾病治疗研究的靶分子和疾病治疗的诊断新指标;另外还广泛存在于细菌各个种属中,作为各种细菌致病性的毒力相关因子,为疾病预防和疫苗制备提供了新方向。随着对二肽基肽酶IV研究的深入,其活性检测方法也得到了不断改善。在碱性条件下,应用Gly-Ρ---ρΝΑ为酶作用底物,水解后生成游离的对硝基苯胺和Gly-PixK甘氨酸-脯氨酸)二肽,利用对硝基苯胺的化学发光性,动态检测405nm处吸光度即可测算出酶活性,此方法检测简易,但缺点是对硝基苯胺毒性为高毒物质,吸入或皮肤接触对人体有害。Promega公司推出一种基于荧光发光团的检测方法,灵敏度更高,速率更快,但检测需要特殊的荧光检测仪,且操作需要避免荧光的淬灭。

【发明内容】

[0003]发明目的:针对上述现 有方案存在的问题和不足,本发明的第一个目的是提供了一种检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒。本发明第二个目的是提供了试剂盒的应用。
[0004]技术方案:为实现上述发明目的,本发明的技术方案如下:一种检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒,包括A液和B液,所述A液是将Gly-PiO-X多肽粉末溶解于PIPES缓冲液中制备而成,所述B液是将四氮唑盐、PMS和NaCl溶解于PIPES缓冲液中制备而成。
[0005]其中,上述PIPES缓冲液浓度为lmol/L。
[0006]其中,上述A液中Gly-Pro-X多肽浓度为50mmol/L。
[0007]其中,上述B液中水溶性四氮唑盐浓度为5mM,PMS浓度为0.2mM,NaCl浓度为
0.15mM0
[0008]其中,上述水溶性四氮唑盐为市售的2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2,4_ 二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐。
[0009]其中,上述PMS为市售的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯。
[0010]上述的检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒在检测二肽基肽酶IV活性方面的应用。
[0011]本发明利用二肽基肽酶IV能够切割肽段N端倒数第二位的脯氨酸的特性,当酶进行水解反应时,切割甘氨酸-脯氨酸-X (Gly-Pro-X)生成甘氨酸-脯氨酸(Gly-Pro)二肽,同时在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在下,四氮唑盐接受酶反应过程中的氢离子,还原成橙黄色水溶性甲赞(formazan),动态检测450nm处吸光度测定二肽基肽酶IV的活性。一个酶活单位定义为在PH7.0,37°C条件下,每分钟消耗一个微摩尔底物Gly-PiO-X所需的酶量。其原理反应方程式见图1。[0012]有益效果:与现有技术相比,本发明水溶性四唑盐以其独特的反应灵敏性和反应产物无毒性,将水溶性四氮唑盐作为二肽基肽酶IV活性检测的指示剂,既能达到高灵敏度的检测范围又对实验者和环境无任何污染。
【专利附图】

【附图说明】
[0013]图1为本发明原理反应图;
[0014]图2为本发明试剂盒应用检测结果图。
【具体实施方式】
[0015]通过下面的实施例可以更详细的解释本发明,公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切变化和改进,本发明并不局限于下面的实施例。[0016]实施例1:检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒的制备
[0017]检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒,包括A液和B液,所述A液是将Gly-PiO-X多肽粉末溶解于PIPES缓冲液中制备而成,所述B液是将四氮唑盐、PMS和NaCl溶解于PIPES缓冲液中制备而成。
[0018]lmol/L PIPES缓冲液的配置:按配比称取PIPES (哌嗪-N,N-双(2-乙磺酸))自由酸,溶解于去离子水中,用NaOH调节PH至6.9,加去离子水定容至lmol/L,微孔滤器过滤除菌,4°C保存备用;
[0019]A液(酶反应底物溶液)的配置:将甘氨酸和脯氨酸的多肽Gly-Pro-X粉末(Gly-Pro-AMC艾美捷科技有限公司购买)溶解于lmol/L PIPES缓冲液中,配成浓度为50mmol/L,微孔滤膜过滤除菌,_20°C保存。
[0020]B液(水溶性四氮唑盐指示液)的配置:按比例分别称取水溶性四氮唑盐、PMS、NaCl粉末溶解于lmol/LPIPES缓冲液中,混合均匀,微孔滤膜过滤除菌,_20°C避光保存。其中水溶性四氮唑盐指示液(B液)包含5mM水溶性四唑盐,0.2mM PMS, 0.15mM NaCl。
[0021]所述的水溶性四氮唑盐为市售WST-8,即2- (2-甲氧基_4_硝苯基)_3_ (4_硝苯基)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四唑单钠盐;
[0022]所述的PMS为市售的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS);本发明试剂盒中采用PIPES作为溶液缓冲液,能提供稳定的水溶性四氮唑盐反应条件和反应灵敏性,PIPES的pKa值接近生理pH,在通过细胞膜的时候不能被吸收,而且可透过紫外线,在370C PIPES能稳定172小时,优于其它缓冲液,常被用来配置染液检测肿瘤细胞等。
[0023]实施例2:检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒的应用
[0024]1、将能分泌产生二肽基肽酶IV的大肠杆菌1ml,LB培养基培养至对数培养期,离心收集细菌菌体,加入磷酸缓冲液制成Iml细菌悬液,超声裂解IOmin, 1000Orpm离心30min收集超声裂解上清,作为待测样本;
[0025]2、将待测样本每孔100 μ I加入96孔酶标检测板,设置三个重复孔;
[0026]3、然后在待测孔中加入10 μ I A液和10 μ I B液,空白对照设置为100 μ I磷酸盐缓冲液中加入10 μ I A液和10 μ I B液,37°C反应10min ;
[0027]4、作为实验对照比较,使用购自其它公司的二肽基肽酶IV检测试剂(PromegaDPPIV-Glo Protease Assay (G8350) IOml),按照步骤 2,3 同时进行实验;[0028]5.酶标仪450nm,每5min检测一次吸光值,记录数据。一个酶活单位定义为每分钟消耗一微摩尔底物Gly-PiO-X所需的酶量。
[0029]实验结果见表1或图2,从表1或图2中可见,本发明配置的检测试剂盒在同样实验条件下,相比较同类试剂灵敏性更好,线性范围更宽。
[0030]本发明的试剂盒与市面上购买的试剂盒相比,检测的OD值比较:
[0031]表1
[0032]
【权利要求】
1.一种检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒,其特征在于,包括A液和B液,所述A液是将Gly-Pro-X多肽粉末溶解于PIPES缓冲液中制备而成,所述B液是将四氮唑盐、PMS和NaCl溶解于PIPES缓冲液中制备而成。
2.根据权利要求1所述的检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒,其特征在于,所述PIPES缓冲液浓度为lmol/L。
3.根据权利要求1所述的检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒,其特征在于,所述A液中Gly-Pro-X 多妝浓度为 50mmol/L。
4.根据权利要求1所述的检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒,其特征在于,所述B液中水溶性四氮唑盐浓度为5mM,PMS浓度为0.2mM, NaCl浓度为0.15mM。
5.根据权利要求1所述的检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒,其特征在于,所述水溶性四氮唑盐为市售的2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2,4_ 二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐。
6.根据权利要求1所述的检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒,其特征在于,所述PMS为市售的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯。
7.权利要求1?6任一项所述的检测二肽基肽酶IV活性的试剂盒在检测二肽基肽酶IV活性方面的应用。
【文档编号】G01N21/31GK103792232SQ201410062487
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】李忠, 马飞飞, 顾玉龙, 钱金蓉 申请人:南京博炫生物科技有限公司
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